乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染在临床上可呈现不同的疾病状态,包括无症状携带、急性肝炎、慢性肝炎、重型肝炎、肝硬化等,与肝癌的发生也密切相关。虽然安全有效的预防性乙肝疫苗广泛应用已使HBsAg携带率显著下降,但对现症慢乙肝的治疗仍然是一个挑战。当前,慢乙肝治疗目标为:最大限度地长期抑制或消除乙肝病毒,延缓和阻止疾病进展,减少和防止肝脏并发症的发生。核苷(酸)类似物类抗病毒药物,如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦及替比夫定,通过作用于HBV的RT区而发挥抗病毒作用,可显著抑制HBV的复制、恢复患者的肝功能、改善肝组织学,部分患者可发生HBeAg的血清转换。但要巩固以上疗效需长期维持治疗。不幸的是,治疗时间的延长可导致HBV耐药株的出现,在临床上引起治疗失败和疾病进展。表型耐药分析通过体外研究HBV对药物的敏感性,一方面可以为已发生耐药的患者提供更为合理的治疗方案,另一方面也可以通过临床分离株评估新药的疗效。迄今为止,并没有一种合适的表型耐药分析方法。本研究第一部分建立了一种新的表型耐药分析方法,通过置换病毒逆转录酶(reverse transcriptase,RT)区段进而研究RT区突变对核苷(酸)类似物类药物敏感性的影响。第二部分对阿德福韦耐药HBV毒株的部分生物学特性进行了研究。第一部分新的HBV表型耐药分析方法的建立目的建立一种新的、简便的表型耐药分析方法,通过置换HBV耐药毒株的RT区来研究RT区变异对于药物敏感性的影响。方法构建包含野毒株HBV全基因组的真核表达质粒PHY536207(B基因型)及PHY97(C基因型)。自GenBank下载B及C基因型HBV全基因组序列各200条,对其RT区序列进行比对,在RT区上下游查找或人工引入酶切位点,以便能将完整的RT区进行置换。通过定点诱变的方法在HBV RT区上游引入PstI酶切位点,诱变成功的质粒命名mPHY536207及mPHY97。利用PstI以及RT区下游自然存在的SphI位点,酶切后进行完整RT区的置换。为了研究定点诱变所产生的变异对HBV本身主要生物学特性的影响,将定点诱变前、后的质粒分别转染Huh7细胞,ELISA方法检测转染细胞上清液中HBsAg的水平,抽提细胞内病毒颗粒HBV DNA,Real-Time PCR检测其水平,观察诱变位点对于HBsAg分泌及HBVDNA复制的影响。以从慢乙肝病人血清中分离到的拉米夫定(Lamivudine,LAM)耐药变异株以及阿德福韦(Adefovir dipivoxil,ADV)耐药变异株为骨架,分别构建LAM耐药株真核表达质粒PHY634和ADV耐药株真核表达质粒PHY6923,同时LAM耐药株和ADV耐药株以模板,扩增耐药变异株的RT区段,分别将其与真核表达质粒mPHY536207中HBV野生株中的RT区相置换,构建真核表达质粒,重组质粒分别命名为RT634(含LAM耐药相关变异)及RT6923(含ADV耐药相关变异)。分别将mPHY536207,PHY634(及RT634转染Huh7细胞,转染次日加用不同浓度的LAM,药物作用7天后抽提病毒颗粒HBV DNA,通过Real time PCR及Southern Blot检测不同LAM浓度作用下HBV DNA的复制水平。同样,将mPHY536207,PHY6923及RT6923转染Huh7细胞,检测不同浓度ADV作用下HBV DNA的复制水平。结果成功构建包含B及C基因型HBV野毒株的真核表达质粒,经转染Huh7细胞,证实有复制能力。通过定点诱变在RT区上游引入PstI酶切位点,转染Huh7细胞,证实此诱变位点对于HBsAg分泌及HBV DNA复制无显著影响。质粒mPHY536207转染Huh7细胞后,随着LAM及ADV浓度的升高,HBV DNA的水平明显下降,而PHY634与RT634转染Huh7细胞后,由于两者RT区均包含LAM耐药相关位点变异,细胞内的HBV DNA并没有随着LAM浓度的升高而下降,同样,PHY6923及RT6923转染细胞后对ADV的敏感性相一致,细胞内HBV DNA的水平没有随着ADV浓度的升高而降低。结论本研究建立的表型耐药分析方法,通过完整的RT区置换来研究RT区不同位点变异对于药物敏感性的影响,无需采用相对较难的基于全基因扩增、克隆的表型分析技术,同时,该方法还具有简便易行、成本较低等优点。第二部分阿德福韦耐药乙型肝炎病毒临床分离株生物学特性的研究目的体外研究阿德福韦耐药相关变异对于HBsAg产生及HBV复制等生物学特性的影响。方法收集在阿德福韦治疗过程中出现病毒学突破患者的血清,对HBV RT区进行PCR扩增和测序分析。对4例有代表性患者的HBV进行全基因扩增、测序、序列分析及克隆。将优势株的HBV全基因插入PHY106载体,构建成1.1拷贝HBV基因组表达载体,转染Huh7细胞,用ELISA法检测细胞培养上清液中HBsAg及HBeAg的水平,了解不同ADV耐药相关变异类型对HBsAg分泌的影响。抽提转染细胞内病毒核心颗粒HBV DNA,用实时荧光定量PCR方法检测HBV DNA的水平。将rtA181T/sW172~*变异株与rtA181野毒株质粒按不同比例混合,共转染Huh7细胞,检测上清中HBsAg及细胞内病毒核心颗粒HBV DNA的水平。结果在12例出现病毒学反跳的患者中,10例含有ADV耐药相关位点变异,以rtA181变异为主,其中5例为rtA181T变异,4例为rtA181T/S+rtN236T变异。包含rtA181T/sW172~*变异的质粒转染细胞后,上清中不能检测到HBsAg,而其他变异类型的质粒转染细胞后,上清液中HBsAg和细胞内病毒核心颗粒HBV DNA的水平与野毒株相似;含有不同变异的HBV临床分离株的细胞内核心病毒颗粒HBV DNA水平未见明显差异;将rtA181T/sW172~*变异株及rtA181野毒株的质粒共转染后,随着rtA181野毒株比例的增加,上清中HBsAg的水平也逐渐增高,但细胞内核心病毒颗粒HBV DNA水平无明显差异。结论rtA181变异是ADV耐药相关性变异的主要类型,rtA181T变异较多见。rtA181T/sW172~*变异株引起HBsAg分泌障碍,rtA181野毒株可纠正rtA181T/sW172~*变异株的HBsAg分泌障碍。不同类型的ADV耐药相关变异对HBV的复制能力无显著影响。