苯妥英是治疗癫痫持续性发作的重要二线药物,其代谢清除中90%由肝细胞色素P450（CYPs）超家族的CYP2C9负责。苯妥英与CYP2C9的抑制剂同服或CYP2C9基因的多态性均可能影响体内苯妥英的血药浓度,是药物不良反应发生的危险因素。水飞蓟宾具有肝脏保护和抗氧化等功能,常作为一种草药类膳食补充剂来使用。癫痫病人可能会同时服用水飞蓟宾和苯妥英,存在潜在的草药-药物相互作用（HDI）进而引起不良反应的风险。而在CYP2C9基因多态性的存在下,这种相互作用可能更为复杂。因此探究CYP2C9单核苷酸多态性存在的情况下,水飞蓟宾对苯妥英代谢的抑制变化,及对联合用药安全性的影响具有重要的临床意义。但目前尚无水飞蓟宾对CYP2C9及其常见单核苷酸突变催化苯妥英代谢影响的定量研究。本论文首先表达并制备了野生型CYP2C9及四种常见单核苷酸突变体,即CYP2C9*1（野生型）、*2、*3、*8和*27。体外酶活性实验表明CYP2C9*2、*3和*8对苯妥英的代谢清除能力较CYP2C9*1低,为弱代谢型,而CYP2C9*27对苯妥英的代谢清除能力较CYP2C9*1高。其次,本研究评价了几种可能与苯妥英同服中药的主要成分基于CYP2C9引发HDI的风险,发现水飞蓟宾可显著抑制苯妥英的代谢产物5-（4羟基苯基）-5-苯基乙内酰脲（p-HPPH）的生成,而且口服四粒Liverman胶囊或水飞蓟宾-磷脂酰胆碱复合物可导致AUC升高超过1.45倍。因此共服水飞蓟宾和苯妥英可能会引起HDI进而引发苯妥英的安全性问题。最后,进一步利用重组CYP2C9及其突变体,定量评价了 CYP2C9单核苷酸突变在水飞蓟与苯妥英的HDI中发挥的作用,结果发现水飞蓟宾A和水飞蓟宾B对CYP2C9不同突变体的抑制作用强度存在差异,进而导致HDI发生的风险性随之变化。预测结果表明,在CYP2C9*1和CYP2C9*8纯和基因型的个体中,苯妥英的血药浓度变化要比CYP2C9*2、*3和*27的个体更为剧烈。论文主要内容包括如下三个部分。第一部分CYP2C9*1、*2、*3、*8和*27与POR的共表达及对苯妥英代谢清除的差异研究目的:将含有CYP2C9*1、*2、*3、*8和*27表达序列的杆状病毒分别与含POR表达序列的杆状病毒共感染昆虫Sf9细胞,制备目标酶。评价所制备的五种CYP2C9对苯妥英代谢清除能力的差异。方法:1.分别培养含CYP2C9*1、*2、*3、*8、*27和PORBacmid的大肠杆菌,并提取CYP2C9*1、*2、*3、*8、*27 和 PORBacmid DNA。将上述五种重组 CYP2C9 及 POR分别转染至Sf9昆虫细胞得到P1代杆状病毒,再连续扩增获得P2和P3代。使用P3代的各CYP2C9分别与P3代POR共感染Sf9昆虫细胞。提取微粒体,获得与POR共表达的重组CYP2C9及其上述常见突变体。经BCA蛋白定量法测定制备的重组酶的蛋白含量,CO差谱法检测重组酶的P450含量,细胞色素c还原实验测定重组酶POR含量。2.配制一系列的苯妥英浓度（0.0005-0.05 mM）的溶液,与上述制备的野生型CYP2C9及常见突变体共孵育,采用超高效液相色谱—串联质谱（UPLC-MS/MS）检测苯妥英的代谢产物p-HPPH生成速率,计算代谢动力学参数并评价CYP2C9常见突变对苯妥英代谢清除的影响。结果:成功制备上述五种重组CYP2C9。CYP2C9*1、*2、*3、*8和*27代谢苯妥英的内在清除率分别为 2.8、1.4、0.15、1.8、3.5 nL/min/pmol P450。结论:成功制备CYP2C9*1、*2、*3、*8和*27。CYP2C9*2、*3和*8对苯妥英的内在清除率较CYP2C9*1低,为弱代谢型,而CYP2C9*27对苯妥英的清除率较CYP2C9*1高。第二部分水飞蓟宾和鸦胆子主要活性成分对苯妥英代谢的抑制作用研究目的:用鸦胆子和水飞蓟主要活性成分对人肝微粒体催化苯妥英代谢的抑制作用进行初筛,评价上述中药制剂与苯妥英共服时产生HDI作用的潜在风险。方法:在人肝微粒体体系中,将鸦胆子苦醇、鸦胆子素D、水飞蓟宾A和水飞蓟宾B分别与苯妥英共孵育。利用UPLC-MS/MS法,选择ESI正离子模式测定苯妥英的代谢产物p-HPPH生成速率。计算产物p-HPPH生成速率的改变,评价鸦胆子苦醇、鸦胆子素D、水飞蓟宾A和水飞蓟宾B对人肝微粒体催化的苯妥英代谢的抑制作用。进一步进行酶动力学分析研究飞蓟宾A和水飞蓟宾B对人肝微粒体催化的苯妥英代谢的抑制动力学参数。通过计算有无抑制剂存在时曲线下面积（AUC）比值,预测水飞蓟宾和苯妥英在体内发生HDI的可能性。结果:水飞蓟宾A对人肝微粒体催化的苯妥英代谢具有强的抑制作用,IC50值为7.67 μM。水飞蓟宾B具有中等抑制作用,IC50值为15.49 μM。而鸦胆子苦醇和鸦胆子素D对人肝微粒体催化的苯妥英代谢无明显抑制作用。进一步的抑制动力学研究表明,在人肝微粒体中水飞蓟宾A对苯妥英代谢产物p-HPPH呈混合性抑制,Ki值为3.85 μM,水飞蓟宾B对苯妥英代谢产物p-HPPH呈竞争性抑制,Ki值为8.75 μM。AUC比值表明,口服四粒Liverman胶囊或水飞蓟宾-磷脂酰胆碱复合物会导致AUC升高超过1.45倍,存在通过抑制苯妥英代谢进而引发其不良反应的风险。结论:水飞蓟制品与抗癫痫药苯妥英联合应用可能导致HDI,存在引发苯妥英不良反应发生的风险。第三部分CYP2C9常见单核苷酸多态性对水飞蓟宾抑制苯妥英代谢的影响目的:第二部分研究发现,水飞蓟宾A和水飞蓟宾B存在抑制苯妥英的代谢进而引发HDI的风险。鉴于CYP2C9存在广泛的基因多态性,会使HDI更为复杂。因此本部分使用第一部分重组的野生型CYP2C9（CYP2C9*1）及其常见单核苷酸突变体（CYP2C9*2、*3、*8和*27）,评价水飞蓟宾A和水飞蓟宾B对苯妥英的抑制动力学,并定量预测不同的CYP2C9单核苷酸多态性通过HDI引发苯妥英不良反应的风险。方法:使用重组CYP2C9*1、*2、*3、*8或*27,将水飞蓟宾A和水飞蓟宾B分别与苯妥英共孵育。利用UPLC-MS/MS法,选择ESI正离子模式测定苯妥英的代谢产物p-HPPH生成速率。计算产物p-HPPH生成速率的改变,评价水飞蓟宾A和水飞蓟宾B对CYP2C9及突变体催化的苯妥英代谢的抑制作用。动力学分析获得飞蓟宾A和水飞蓟宾B对CYP2C9及突变体催化的苯妥英代谢的抑制动力学参数。最后通过计算曲线下面积（AUC）比值预测水飞蓟宾和苯妥英在体内发生HDI的可能性。结果:水飞蓟宾A对CYP2C9*1、*2、*3、*8和*27催化的苯妥英代谢抑制IC50值分别为 5.16、16.52、6.70、8.20 和 11.04μM。水飞蓟宾 B 对 CYP2C9*1、*2、*3、*8 和*27催化的苯妥英代谢抑制的IC50值分别为7.90、24.68、8.06、17.82和11.94 μM。与水飞蓟宾B相比,水飞蓟宾A对CYP2C9及所有突变体均具有更强的抑制作用。进一步的动力学研究显示,水飞蓟宾A对CYP2C9*1和CYP2C9*3介导的苯妥英代谢呈竞争性抑制,Ki分别为5.12 μM和6.72 μM;对CYP2C9*8和CYP2C9*27介导的苯妥英代谢呈非竞争性抑制,Ki分别为6.08 μM和10.69 μM;对CYP2C9*2介导的苯妥英代谢呈混合性抑制,Ki为9.30 μM。而水飞蓟宾B对CYP2C9*1和CYP2C9*8介导的苯妥英代谢呈竞争性抑制,Ki分别为7.93 μM和6.21 μM;对CYP2C9*2和CYP2C9*3介导的苯妥英代谢呈混合性抑制,Ki值分别为22.36 μM和8.56 μM;对CYP2C9*27介导的苯妥英代谢呈非竞争性抑制,Ki值为12.42μM。口服四粒Liverman胶囊或水飞蓟宾-磷脂酰胆碱复合物时,在CYP2C9*1和CYP2C9*8纯和基因的个体中AUC 比值可能超过1.45,有引发HDI的风险。而CYP2C9*2、*3和*27纯和个体的AUC比值则低于 1.45。结论:水飞蓟宾A和水飞蓟宾B在体外可抑制CYP2C9及其常见单核苷酸突变体介导的苯妥英代谢。在CYP2C9*1和*8的个体中AUC的变化高于CYP2C9*2、*3和*27的个体。用药时需注意根据突变调整用药剂量。