第一部分肾癌肿瘤局部Treg与肿瘤预后关系及与肿瘤COX-2表达的相关性目的本部分旨在从细胞水平了解肾癌局部免疫微环境中T淋巴细胞的亚型、数目与肾癌各项临床指标及预后的关系,并通过与肿瘤中COX-2表达的相关性分析,探讨肿瘤局部调节性T细胞增多的可能机制。方法本研究收集1999年1月～2005年12月在复旦大学附属中山医院行根治性肾切除或部分肾切除的肾透明细胞癌患者资料,随机选取其中有完整随访资料的125例肾癌石蜡标本,借助于高通量的组织微阵列及免疫组化染色,研究肿瘤中与癌旁微环境中CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、FOXP3⁺调节性T细胞、GranzymeB⁺活化的细胞毒性T细胞的数目、COX-2的表达情况与肿瘤各项临床指标及预后的关系,并探讨COX-2表达与调节性T细胞的相关性。结果（1）不同患者免疫细胞浸润程度不同,肾癌的淋巴细胞以分散形式或聚集体形式存在,以癌旁淋巴细胞浸润更加明显。（2）单因素生存分析显示患者年龄、性别与肾癌预后无关,肿瘤中及癌旁CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、Granzyme B⁺活化的细胞毒性T细胞表达与肾癌预后无关;而癌旁调节性T细胞增多与总生存率及疾病无进展生存率呈显著负相关（P＜0.001,P＜0.001）,肿瘤中COX-2高表达也与总生存率及疾病无进展生存率呈显著负相关（P=0.021,P=0.027）。但肿瘤中调节性T细胞、癌旁COX-2表达与肾癌预后无关。肿瘤TNM分期、肿瘤核分级和肿瘤大小均与肾癌预后相关。（3）多因素Cox生存分析显示癌旁调节性T细胞增多、肿瘤TNM分期增加（Ⅲ、Ⅳ期）、肿瘤核分级增加（3、4级）和肿瘤直径增大（≥7cm）提示肾癌预后不良。相关性分析显示癌旁调节性T细胞数目与肿瘤TNM分期及肿瘤直径呈正相关（P=0.001,P=0.002）,肿瘤中Granzyme B⁺T细胞数目与肿瘤核分级呈正相关（P=0.024）,而COX-2表达程度与肿瘤TNM分期和肿瘤核分级呈正相关（P=0.018,P=0.013）;癌旁调节性T细胞与肿瘤中COX-2表达呈正相关（P＜0.001）。结论结果表明,肾癌癌旁调节性T细胞增多与肿瘤TNM分期增加（Ⅲ、Ⅳ期）、肿瘤核分级增加（3、4级）和肿瘤直径增大（≥7cm）均可作为肾癌不良预后的一个独立指标。癌旁调节性T细胞与肿瘤中COX-2表达呈正相关,基于COX-2来源的PGE₂可诱导非调节性T细胞向调节性T细胞转化,因此肾癌可能通过相同机制诱导调节性T细胞生成,进而促进肿瘤发生免疫逃逸。第二部分肾癌局部Treg来源及其机制研究2.1 pcDNA3.1-hCOX-2真核表达质粒的构建目的构建pcDNA3.1-hCOX-2真核表达质粒。方法以pSG5-COX-2为模板,PCR获得人COX-2cDNA全长,EcoRI、BamHI双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒。结果重组真核表达质粒pcDNA3.1-hCOX-2经限制性内切酶酶切,电泳后显示1800bp左右的hCOX-2目的片段和5.4kb的pcDNA3.1载体片段,测序证实1800bp的酶切片段与Gene-bank登记的COX-2序列相同。结论成功构建pcDNA3.1-hCOX-2真核表达质粒并可用于后续转染。2.2 pcDNA3.1-hCOX-2转染对肾癌细胞株COX-2表达及上清中PGE₂生成的增强作用目的测定常见肾癌细胞株COX-2表达,挑选COX-2高表达的肾癌细胞株进入后续转染实验;将pcDNA3.1-hCOX-2真核表达质粒通过脂质体lipofectamine 2000转染COX-2高表达的肾癌细胞株,了解对COX-2 mRNA及蛋白影响,尤其对肿瘤细胞上清中PGE₂分泌影响;转染组中分别加入不同剂量NS-398,了解其对上清中PGE₂分泌影响。方法（1）引入两种常见肾癌细胞株:786-0和OS-RC-2,分别进行体外培养。半定量RT-PCR方法测定两种肾癌细胞株COX-2 mRNA的表达水平;Western-blot方法测定两种肾癌细胞株COX-2蛋白的表达水平。（2）将pcDNA3.1-hCOX-2真核表达质粒通过脂质体lipofectamine2000转染COX-2高表达的肾癌细胞株OS-RC-2;转染72小时后,半定量RT-PCR测定肾癌细胞株OS-RC-2中COX-2 mRNA的表达水平,Western-blot测定COX-2蛋白表达水平,确定转染效果。（3） ELISA方法检测转染对肾癌细胞株OS-RC-2的PGE₂分泌影响,转染组分别加入12.5μM、25μM、50μM、100μM NS-398,ELISA方法检测各组上清中PGE₂含量变化。结果（1）两种肾癌细胞株COX-2mRNA和蛋白表达水平均不同。半定量RT-PCR测定结果:以两种肾癌细胞株COX-2/beta-actin作比较,786-0和OS-RC-2的比值分别为0.2756±0.01318、0.4667±0.02159,前者为后者表达量的59.1%,结果在统计学上有显著性差异（P＜0.05）。Western-blot测定结果:以两种肾癌细胞株COX-2/GAPDH作比较,786-0和OS-RC-2的比值分别为0.2333±0.02183、0.4686±0.04294,前者为后者表达量的50%,结果在统计学上有显著性差异（P＜0.05）。后续转染实验选择肾癌细胞株OS-RC-2。（2）肾癌细胞株OS-RC-2转染pcDNA3.1-hCOX-2真核表达质粒后COX-2mRNA和蛋白表达水平均明显升高。半定量RT-PCR结果:转染72小时后COX-2 mRNA在转染组、空转组和对照组COX-2/beta-actin比值分别为0.7922±0.07139、0.4325±0.02045、0.4739±0.02377,两两比较结果显示转染组明显高于空转组和对照组,统计学有明显差异（P＜0.05）;后两者比较统计学无明显差异（P＞0.05）。Western-blot测定结果:转染72小时后COX-2蛋白在转染组、空转组和对照组COX-2/GAPDH比值分别为0.8593±0.1332、0.4321±0.03362、0.4533±0.05883,两两比较结果显示转染组明显高于空转组及对照组,统计学有明显差异（P＜0.05）;后两者比较统计学无明显差异（P＞0.05）。（3）ELISA检测发现转染组肿瘤细胞上清中PGE₂分泌明显高于空转组和对照组,分别为6.330±1.181、0.2817±0.03181、0.3030±0.03246,两两比较结果显示转染组明显高于空转组和对照组,统计学有明显差异（P＜0.05）;后两者比较统计学无明显差异（P＞0.05）。转染组应用NS-39812.5μM、25μM、50μM、100μM之后,PGE₂含量分别为2.906±0.5892、0.6484±0.09880、0.4189±0.06513、0.2221±0.04094 ng/ml,两两比较结果显示转染组明显高于转染组+12.5μMNS-398组、转染组+25μMNS-398组、转染组+50μMNS-398组、转染组+100μMNS-398组,统计学上有明显差异（P＜0.05）。结论（1）肾癌细胞株786-0和OS-RC-2均有COX-2表达,但前者COX-2表达无论在mRNA水平或蛋白水平均低于后者,后续转染实验选择OS-RC-2作为靶细胞株。（2）所构建pcDNA3.1-hCOX-2真核表达质粒可通过脂质体lipofectamine 2000转染肾癌细胞株OS-RC-2,增加OS-RC-2中COX-2表达水平。（3） pcDNA3.1-hCOX-2真核表达质粒转染可增强转染肾癌细胞株OS-RC-2上清中PGE₂分泌,而应用NS-398可以剂量依赖性地降低转染OS-RC-2上清中PGE₂分泌。2.3 pcDNA3.1-hCOX-2转染肾癌细胞株上清诱导CD4⁺FOXP3^-T细胞向Treg转化目的了解转染肾癌细胞株OS-RC-2上清是否可诱导CD4⁺FOXP3T细胞向CD4⁺FOXP3⁺调节性T细胞转化。方法密度梯度离心法获得外周血单个核细胞,免疫磁珠细胞分选获得CD4⁺CD25^-效应T细胞和CD4⁺CD25⁺调节性T细胞,RT-PCR及FACS检测分选细胞的纯度。anti-CD3/CD28抗体和灭活APC细胞活化条件下,将分选的CD4⁺CD25^-T细胞分别与PGE₂阳性对照组、转染组、转染+100μM对照抗体、转染+100μMNS-398、阴性对照组的上清共孵育96小时,FACS检测各组细胞中CD4⁺FOXP3⁺调节性T细胞比例。结果（1）免疫磁珠细胞分选可稳定获得CD4⁺CD25^-效应T细胞和CD4⁺CD25⁺调节性T细胞,二者纯度均大于90%,后者特异性表达FOXP3基因和蛋白。（2）转染组上清可明显诱导CD4⁺FOXP3^-T细胞向CD4⁺FOXP3⁺调节性T细胞转化,96小时后CD4⁺FOXP3⁺调节性T细胞占CD4⁺T细胞比率为30.00±2.618%,而与转染+100μMNS-398组上清共孵育后CD4⁺FOXP3⁺调节性T细胞生成明显降低,96小时后CD4⁺FOXP3⁺调节性T细胞占CD4⁺T细胞比率仅为7.990±1.227%。结论（1）免疫磁珠细胞分选可稳定获得CD4⁺CD25^-效应T细胞和CD4⁺CD25⁺调节性T细胞,由于CD4⁺CD25⁺调节性T细胞特异性表达FOXP3基因和蛋白,后续部分以CD4⁺FOXP3⁺调节性T细胞代表CD4⁺CD25⁺调节性T细胞,CD4⁺CD25^-效应T细胞中FOXP3表达阴性,后续部分以CD4⁺FOXP3^-T细胞代表CD4⁺CD25^-效应T细胞。（2）转染肾癌细胞株上清可诱导CD4⁺FOXP3^-T细胞向CD4⁺FOXP3⁺调节性T细胞转化,而NS-398可以减弱转染肾癌细胞上清所诱导的调节性T细胞生成,提示COX-2抑制剂可通过减少调节性T细胞生成,诱发局部抗肿瘤免疫反应来辅助治疗肾癌。