汉坦病毒是负链RNA病毒,基因组RNA分为三个节段:L、M和S。调控汉坦病毒转录、复制以及包装的信息被认为存在于病毒的非编码区（Noncodingregions,NCR）部分,由于5’和3’末端碱基有部分反向互补,所以通常由氢键形成“锅柄状”双链结构,呈现为环状RNA,提供和病毒多聚酶相互作用的功能性启动子区。和同一家族的其它负链RNA病毒一样,多聚酶催化转录和复制的模板是核糖核蛋白（ribonucleoproteins,RNP）,包括全长RNA片段、核蛋白和病毒多聚酶的复合体。我们将报告基因绿色荧光蛋白（GFP）分别嵌入到汉坦病毒A9和L99株的L、M和S节段的5’和3’末端的非编码区的互补序列之间,再分别将这3个嵌合的cDNA反向克隆到具有RNA聚合酶Ⅰ的启动子和终止子的载体pHH21中。将此3个质粒分别转染Vero-E6细胞,A9（L99）病毒辅助感染,观察GFP表达量的差别,以了解汉坦病毒启动子序列的特征以及3个节段的5’和3’末端非编码区分别对于蛋白表达的调控作用。结果发现3个片段的NCRs均可以启动微复制子的转录和复制;GFP在不同NCRs中的表达量不同:嵌入M片段的5’端和3’端非编码区的GFP的表达量高于嵌入L片段的5’端和3’端非编码区的GFP的表达量,而后者又高于嵌入S片段的5’端和3’端非编码区的GFP的表达量。报告基因的表达并非仅特异性的与复制和转录有关,虽然这两个过程都可以影响报告基因mRNA的量。为了更好的反映微复制子中非编码区对复制和转录的调控能力,除去翻译过程对报告基因表达量的影响,比如mRNA的稳定性等,我们同时应用了定量PCR的方法来检测细胞中GFP mRNA的含量。结果发现3个节段报告基因的mRNA量有所不同,M＞L＞S,与GFP表达量的检测结果类似。该研究结果表明,汉坦病毒3个片段非编码区的启动子强度从M、L、S依次递减。M片段非编码区的调控能力最强,为我们接下来选择M片段非编码区连接GFP建立汉坦病毒指示细胞系奠定了基础。汉坦病毒RNA在基因片段的3’和5’末端都是高度保守的。每一个基因片段的3’端均为AUC AUC AUC UG,并与5’端反向互补。基因的3’和5’端形成稳定的锅柄状（panhandle）结构,可以在电子显微镜下观测证实,这种锅柄状结构也是布尼亚病毒科的一个重要标志。汉坦病毒锅柄状结构被认为在病毒的复制、转录和包装方面起着非常重要的作用。已经证实汉坦病毒属的辛诺柏病毒、安第斯、普马拉及首尔病毒的核蛋白可以形成三聚体结构,并且可以特异性的识别它们病毒基因组的这种锅柄状结构,具有种属内的特异性和亲和力。在病毒复制的起始阶段,核蛋白三聚体和锅柄状结构的相互作用可以帮助病毒的多聚酶识别和结合病毒RNA分子,而RdRp和核蛋白是病毒基因组复制所必需的,这些已经在体外和体内实验中得到证实。汉坦病毒一般不引起可见的细胞病变,只有在低pH值的培养基中可能出现细胞融合现象,这使得传统的细胞病变（Cytopathic effects,CPE）的方法不能被广泛的使用。汉坦病毒在细胞内生长缓慢,一般需7～14d病毒滴度才达高峰,通常需采用免疫学方法进行鉴定,存在耗时长,工作量大和灵敏度低等问题。由于汉坦病毒存在较高的序列变异,RT-PCR需要相对高的技能和设备条件,而且不能检测病毒感染的情况,基于RT-PCR的方法也因此未能得到大规模的推广。目前,基于激活泡沫样病毒（FVs）的LTR（Long termihal repeats,LTR）的指示细胞系的方法已经建立。病毒的滴度可以通过检测LTR下游的报告基因的表达来检测。报告基因主要包括β半乳糖苷酶（β-gal）,萤火虫荧光素酶（luc）和绿色荧光蛋白（GFP）基因等。来自于海洋生物维多利亚水母的GFP作为报告基因具有不需任何底物标记、荧光性质稳定、对细胞无毒性、可行活细胞观察等优点,既直观易用,又可定量检测,直接将基因表达的时间和空间联系起来。在这些报告基因中,检测GFP是最简单的,因为它不需要酶作用或固定细胞,这种指示细胞系已经成功的应用于牛及人泡沫样病毒等的检测。基于本文第一部分汉坦病毒M片段非编码区激活可以较强的调控表达GFP,本研究建立了一种检测汉坦病毒的新方法。我们在汉坦病毒A9株M片段的非编码区中连入GFP基因的质粒,反向接入PolⅠ的启动子和终止子之间,然后连接到含潮霉素β抗性的载体,转染Vero-E6细胞。应用潮霉素B筛选,得到十一个独立的细胞系,评估它们的稳定度和敏感度,结果显示其中一个细胞系具有检测汉坦病毒的理想特性。该细胞系可以在连续传代培养中保持较佳的稳定性;在未受汉坦病毒感染的细胞中,报告基因并不表达;报告基因的表达对于汉坦病毒属内具有专一性;此方法较传统的间接免疫荧光检测具有相似的灵敏度;利用此细胞系来定量汉坦病毒的滴度与传统方法具有较好的相关性。本研究成功获得了以GFP为报告基因的汉坦病毒指示细胞系,可以特异性的识别汉坦病毒,并且可以随时动态观察。利用该指示细胞系检测汉坦病毒比传统的免疫学方法更加简便、快捷,具有较好的特异性。该指示细胞系还可以用于检测受体功能、细胞内信号传导、基因表达、病毒感染和增殖、汉坦病毒的直观快速检测及抗病毒药物的筛选等。目前预防汉坦病毒感染的疫苗主要是乳鼠脑纯化疫苗和地鼠/沙鼠肾细胞疫苗。但以脑组织及原代细胞作为疫苗生产基质来源复杂,不利于生产和质量控制,并且需要采取注射途径,不容易被接受。汉坦病毒主要通过其宿主动物排泄物及分泌物经消化道传播或以气溶胶形式经呼吸道等途径传播,根据疫苗设计中的“原位免疫设计原则”,通过粘膜疫苗进行免疫是合乎逻辑的。粘膜疫苗可以减少疫苗的剂量,降低成本,应用方便,是很有前途新型实用疫苗。粘膜免疫避免了注射引起的强烈应缴,更易被接受;避免了由于注射免疫引起血源性传播疾病;安全易行,省时省力;可以同时诱导粘膜和全身免疫应答,是一种全面而系统的免疫方法。对粘膜免疫的途径的研究发现,滴鼻免疫可以直接将抗原呈递到其摄取部位,更早和更强的诱发粘膜免疫反应,比经消化道免疫需要更少的抗原,效率更高。滴鼻免疫除可以诱发粘膜免疫反应外,还可以诱发T、B细胞免疫,并且相对于口服疫苗来说,更少导致免疫耐受。基于滴鼻免疫具有上述优点,我们在本研究中选择滴鼻免疫途径。多数疫苗在通过粘膜途径进行接种时不能诱使机体产生免疫反应,需要辅以免疫佐剂。大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）来自于产毒大肠杆菌,具较强的黏膜佐剂效应。LT和霍乱毒素（CT）的结构有80%的同源性,均由一个A亚单位和一个五聚体B亚单位构成。五个B亚单位聚合形成中空的面包圈样结构,中心与A亚单位非共价键结合。目前研究发现其B亚单位（B submit of Heat-labileenterotoxin,LTB）的功能是通过其上的神经节苷脂（Ganglioside,GM1）结合受体而使全毒素黏附于真核细胞上,是无毒的,但仍然具有很强的粘膜佐剂活性,是比较理想的粘膜佐剂之选。LTB分子量为12.8kD左右,天然状态下为五聚体形式存在,其在细胞质中合成后在信号肽作用下分泌到周质腔中形成五聚体并与相应A亚单位组成完整的大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）,由于LTB分子量较小,所以在体外较难表达。本研究模拟LTB天然合成途径,采用pET22b原核表达载体进行分泌表达,为了便于下游纯化和应用,采用无毒的乳糖代替IPTG诱导LTB表达。发现采用工作浓度为10g/L的乳糖额外诱导培养6h,目的蛋白可占菌体总量的30%。之后采用Ni²⁺亲和层析纯化,最终在体外成功获得纯化的LTB,神经节甘酯（GM1）结合实验表明所获得的LTB具有较好的生物活性。pET22b（+）原核表达载体是Novagen公司pET表达系统中的一员,目的基因通过基因克隆技术插入到pET表达载体中,并受T7转录及翻译调控序列控制,T7启动子是目前原核表达中最强的启动子,表达效率非常高,本研究所表达的rLTB可占菌体总蛋白的30%,1L菌液发酵最终可得9mg纯化rLTB蛋白,足够用于后续的佐剂生产。T7启动子的调控遵循乳糖操作子原理,可以采用乳糖作为诱导剂,乳糖价格低廉,并且无毒安全,所以在后期的疫苗试生产中具有重要意义。选取6-8周龄C57BL/6雌性小鼠,随机分成4组,每组6只,阳性对照组为灭活病毒和铝剂配伍的皮下注射;阴性对照组有单独用灭活汉坦病毒滴鼻组和PBS滴鼻对照组。免疫时间次数为常规免疫,即免疫3次。分别在0,14天,28天,其中在第3.5,7,14,35天尾静脉取血分离血清:PBS冲洗阴道获阴道冲洗液。结果发现,以rLTB为佐剂的灭活汉坦病毒滴鼻免疫组产生了抗汉坦病毒的体液免疫和粘膜免疫应答,而单独用灭活汉坦病毒滴鼻未能产生有效的抗汉坦病毒核蛋白抗体水平。该结果提示以rLTB为佐剂经鼻粘膜免疫途径可以诱导小鼠产生针对汉坦病毒的特异性体液免疫和粘膜免疫应答,研究汉坦病毒的粘膜免疫疫苗是可行的。总之,本研究通过构建以GFP为报告基因的微复制子,对GFP在蛋白水平和mRNA水平进行比较,发现汉坦病毒非编码区S、M和L片段均能调控GFP表达,三个片段非编码区启动子调控能力有差别,为M＞L＞S。汉坦病毒的核蛋白可以形成三聚体结构,并且可以特异性的识别它们病毒基因组的这种锅柄状结构,具有种属内的特异性和亲和力。基于以上研究,我们成功建立了以GFP为报告基因的汉坦病毒指示细胞系,该细胞系在无汉坦病毒感染时GFP不表达,可以特异性的识别汉坦病毒,并且可以随时动态观察。利用该指示细胞系检测汉坦病毒比传统的免疫学方法更加简便、快捷。本研究还采用无毒的乳糖代替IPTG诱导LTB原核表达,成功制备了大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位,并和灭活汉坦病毒配伍,滴鼻免疫小鼠,发现以rLTB为佐剂的灭活汉坦病毒滴鼻免疫组产生了较强的抗汉坦病毒核蛋白的体液免疫和粘膜免疫应答,为汉坦病毒粘膜疫苗的研究提供了依据。