铁是人体必需微量元素中含量最多的一种,参与机体许多重要的生理功能,铁过多或过少对机体都会造成损害。铁缺乏对人体影响被了解的同时,铁过负荷对人体的危害也越来越受到重视。有资料显示,肝铁过负荷可导致肝纤维化、肝硬化；迟发性皮肤卟啉症和肝细胞癌等疾病。肝脏是机体铁贮存的主要部位,在铁代谢中发挥着中心和枢纽的作用。为了维持铁平衡,肝细胞存在精细的铁调控机制,可以维持正常生命活动所需的铁量,同时又会避免铁过多蓄积而产生的毒性作用。然而课题组研究发现心理应激可以引起肝铁蓄积,肝细胞氧化应激损伤,但机制尚不明确。众所周知,应激情况下糖皮质激素大量分泌,文献报道,糖皮质激素能够调控大鼠肠道内铁蛋白轻链重链的表达,增加垂体切除鼠体内的转铁蛋白受体1的含量,有意义的是,课题组前期研究结果发现应激情况下,糖皮质激素受体和STAT5与铁调节蛋白1基因启动子位点上的相应DNA序列结合活性增强,综合国内外相关研究,提示心理应激情况下的肝铁蓄积可能与糖皮质激素的大量分泌导致铁调控蛋白的表达改变有关。应激在现代社会无处不在,阐明应激肝铁紊乱的机制对防治应激损伤具有积极的意义。研究目的了解心理应激糖皮质激素大量分泌与肝铁蓄积的关系,及心理应激导致肝铁蓄积的机制,为阐明心理应激情况下肝铁代谢紊乱、肝铁蓄积的机制提供实验基础,并为防治与肝铁蓄积相关的疾病提供线索。研究方法1.心理应激对大鼠肝铁浓度及铁调控蛋白的影响1.1实验动物分组雄性SD大鼠(购自上海西普尔-必凯公司),体重(120±10)g。按体重随机分为空白对照组、心理应激组和足底电击组,每组10只。动物饲养实验室环境温度24℃±1℃,湿度50%～60%；使用不锈钢笼具单笼饲养,自由饮食,自然昼夜节律变化光照。1.2大鼠心理应激模型的制作采用Communication Box System制作大鼠心理应激模型。Communication Box System由透明丙烯酸板组成,一半小室(A室)底部铺板绝缘,另一半小室(B室)通电。在B室的实验大鼠接受30min/d,足底电击(电压90V,电流0.80mA)；电击组大鼠跳跃,尖叫,在A室的实验大鼠通过视觉听觉产生恐惧的心理反应,即为心理应激大鼠模型。1.3大鼠肝组织铁含量的测定采用原子吸收分光光度计(日本日立公司Z-2000型)火焰法测定。100μ/ml铁标准贮备液(GBW08616)由国家标准物质中心提供。1.4大鼠肝脏Fn, TfR1, IRP1, IRP2 mRNA表达量的测定采用实时定量荧光PCR法测定心理应激组和对照组大鼠肝脏内铁蛋白,转铁蛋白受体1,铁调节蛋白1及铁调节蛋白2 mRNA的表达水平。1.5大鼠肝脏Fn,TfR1,IRP1蛋白含量的测定Western blot测定实验组和对照组大鼠肝脏内铁蛋白,转铁蛋白受体1以及铁调节蛋白1的蛋白含量。2.注射糖皮质激素对肝铁浓度及铁调控蛋白的影响2.1实验动物分组雄性SD大鼠(购白上海西普尔-必凯公司),体重(200±10)g。按体重随机分为0.9%生理盐水组,10-9 mol/L皮质酮组,10-6mol/L皮质酮组和RU486组,每组10只。动物饲养实验室环境温度24℃±1℃,湿度50%～60%；使用不锈钢笼具单笼饲养,自由饮食,自然昼夜节律变化光照。2.2实验动物模型制作大鼠尾静脉注射0.9%生理盐水,10-7mol/L皮质酮,10-4 mol/L皮质酮或10-2mol/L RU486(1h后再注射104 mol/L皮质酮),按照0.1ml/100g bw注射试剂,连续7天注射后腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉,暴露胸腔,剪开右心耳,然后迅速经心脏冷PBS冲洗,取出大鼠肝脏存-80℃冰箱备用。2.3大鼠肝组织铁含量的测定：同前。2.4大鼠肝脏Fn,TfR1,IRP1mRNA和蛋白含量的测定：同前。3.糖皮质激素调控肝细胞铁调节蛋白1表达的分子机制研究3.1细胞培养选用人正常肝细胞HL7702, RPMI1640培养液中加入10%胎牛血清、双抗,培养箱中生长。3.2氢化可的松干预细胞用精密电子天平称取3.6247mg的氢化可的松,用无水乙醇稀释溶解至1ml,配成10-2mol/L,用1640培养液稀释成10-5,10-6,10-7,10-8,10-9mol/L后加入HL7702细胞。3.3 CCK-8法测定肝细胞活性弃去培养HL7702细胞96孔板中的上清,PBS漂洗3次加入CCK-8反应液,于37℃孵育2h,使用酶标仪450 nm波长处测定吸光度(A)值。以实验组吸光度值与对照组的吸光度值之百分比作为细胞相对活性。3.4阻断HL7702细胞内糖皮质激素受体或STAT5用精密电子天平称取4.2959mg的RU486,用无水乙醇稀释溶解至1ml,配成10-2mol/L的RU486,用1640培养液稀释为10-5mol/L后加入HL7702细胞,半小时后再加入10-6mol/L氢化可的松。用精密电子天平称取适量STAT5抑制剂溶于DMSO,使终浓度达到10mg/ml。3.5肝细胞IRP1和STAT5 mRNA及蛋白含量的测定实时定量荧光PCR法测定mRNA的表达水平,Western blot测定蛋白含量的变化。4.数据的统计与处理采用quantity one图像分析系统对Western条带进行灰度分析,实验数据用(X±S)表示。应用SPSS11.5统计软件进行实验数据分析,两组间差异采用成组设计资料的t检验,多组间差异采用单因素方差分析。各组方差齐时,对照组与各实验组间比较采用Dunnett法,各组间两两比较采用LSD-t检验和SNK-q检验；方差不齐时采用Dunnett’s C检验,P<0.05为显著性水平,P<0.01为非常显著性水平。结果1.心理应激对大鼠肝铁浓度及铁调控蛋白的影响1.1心理应激对大鼠肝铁含量的影响7天心理应激组大鼠肝铁含量与对照组比较升高幅度达到52.7%(P<0.01)；与1天和3天心理应激组比较分别升高了40.8%(P<0.01)和31.8%(P<0.05)而1天和3天心理应激组大鼠肝铁含量较对照组有升高趋势,但无统计学意义(P>0.05)。1.2心理应激对大鼠肝脏Fn, TfR1, IRP1, IRP2 mRNA表达的影响大鼠肝脏Fn mRNA表达在1天和3天心理应激后与对照组比较有降低趋势,在7天心理应激后较对照组明显降低(P<0.05)；大鼠肝脏TfR1 mRNA表达在1天和3天心理应激后与对照组比较有升高趋势,7天心理应激后较对照组明显升高(P<0.05)；而大鼠肝脏IRP1 mRNA表达在1,3,7天心理应激后较对照组均有显著升高,其中7天心理应激组升高幅度最大,达到36%(P<0.05)；大鼠肝脏IRP2mRNA表达各组间均无明显变化(P>0.05)。1.3心理应激对大鼠肝脏Fn, TfR1, IRP1蛋白含量的影响心理应激1天和3天时,大鼠肝脏Fn, TfR1蛋白表达与对照组相比无显著性差异,7天心理应激时与对照组相比,大鼠肝脏Fn蛋白表达降低,而TfRl蛋白表达升高(P<0.05)；1,3,7天心理应激组大鼠肝脏IRP1蛋白表达较对照组均有增加,分别增加1.5倍(P<0.05),1.8倍(P<0.05)和2.6倍(P<0.01)2.注射糖皮质激素对大鼠肝铁浓度及铁调控蛋白的影响2.1注射皮质酮对大鼠肝铁含量的影响10-9mol/L皮质酮组大鼠肝铁含量与0.9%生理盐水组相比无显著差异,但连续7天每天注射10-6mol/L皮质酮后,大鼠肝铁含量与0.9%生理盐水组比较有显著上升,升高39.5%(P<0.05),与连续7天注射10-9mol/L皮质酮组比较也升高了39.1%(P<0.05)2.2注射皮质酮对大鼠肝脏Fn, TfR1, IRP1 mRNA表达的影响10-9mol/L皮质酮组Fn, TfR1 mRNA的表达与0.9%生理盐水组相比无显著性差异,而10-6 mol/L皮质酮连续注射7天后Fn mRNA表达较0.9%生理盐水组降低,TfR1 mRNA表达较生理盐水组升高,大鼠肝脏IRP1 mRNA表达在注射10-9和10-6。mol/L皮质酮后较0.9%生理盐水组均有升高,分别较对照组增高1.2倍和1.5倍(P<0.05)。2.3注射皮质酮对大鼠肝脏Fn,TfR1,IRP1蛋白含量的影响Western blot显示大鼠肝脏Fn,TfR1蛋白表达在连续7天给予10-9mol/L皮质酮后与0.9%生理盐水组相比无显著性差异,而连续注射10-6mol/L皮质酮7天后,与0.9%生理盐水组比较,Fn蛋白表达降低,TfR1蛋白表达升高(P<0.05),10-9mol/L和10-6mol/L皮质酮组的IRP1蛋白表达较0.9%生理盐水组均升高(P<0.05)3.糖皮质激素调控肝细胞铁调节蛋白1表达的分子机制研究3.1氢化可的松对HL7702细胞IRP1mRNA表达的影响细胞内加入10-6,10-7,10-8,10-9。mol/L氢化可的松24h后HL7702细胞IRP1mRNA表达较对照组均增高,分别增高1.65倍,1.38倍,1.37倍和1.38倍(P<0.05),10-6mol/L氢化可的松组的IRP1 mRNA表达较其他剂量氢化可的松组均增高(P<0.05),而10-5mol/L糖皮质激素组IRP1mRNA表达与对照组无显著差异。3.2氢化可的松对HL7702细胞IRP1蛋白含量的影响Western blot结果显示细胞内加入10-6,10-7,10-8,10-9mol/L氢化可的松24h后HL7702细胞IRP1蛋白含量较对照组均增高(P<0.05),其中10-6mol/L氢化可的松组IRP1蛋白含量与10-7mol/L组比差异不显著(P>0.05),与10-8,10-9mol/L组比较IRP1蛋白含量均增高(P<0.05),而10-Smol/L组IRP1含量与对照组无显著差异,CCK-8检测显示,10-5mol/L组的肝细胞活性与对照组相比显著降低(P<0.01)。3.3阻断糖皮质激素受体对大鼠肝脏IRP1含量的影响大鼠尾静脉注射10-4mol/L糖皮质激素受体阻断剂RU486 1小时后注射10-6mol/L皮质酮,发现IRP1 mRNA表达较10-6mol/L皮质酮组明显降低(P<0.05)。IRP1蛋白含量变化与mRNA一致,RU48+皮质酮组大鼠肝脏IRP1蛋白含量较单纯加皮质酮组明显降低(P<0.05)。3.4阻断糖皮质激素受体对HL7702细胞IRP1含量的影响RT-PCR结果显示HL7702细胞内加入10-5 mol/L RU486后可以降低氢化可的松诱导的IRP1的生成,与10-6mol/L氢化可的松组对比降低达3倍(P<0.05)。Western blot结果同样显示RU486可以降低氢化可的松诱导的IRP1蛋白生成。3.5氢化可的松对STAT5表达的影响HL7702细胞内加入10-6mol/L氢化可的松后,STAT5的mRNA及蛋白表达较对照组均无显著差异(P>0.05),Western blot结果显示,在给予10-6mol/L氢化可的松后,HL7702细胞内P-STAT5蛋白含量较对照组明显升高(P<0.05)。3.6抑制STAT5对HL7702细胞IRP1生成的影响抑制STAT5后,HL7702细胞IRP1蛋白表达较10-6mol/L氢化可的松组明显降低(P<0.05)。3.7同时阻断糖皮质激素受体和STAT5对HL7702细胞IRP1生成的影响当同时阻断糖皮质激素受体和STAT5后再给予氢化可的松,HL7702细胞中IRP1蛋白几乎不表达,与10-6mol/L糖皮质激素组比较差异非常显著(P<0.01)。结论1.连续7天心理应激可以引起大鼠肝脏铁蛋白表达减少,而转铁蛋白受体1表达增加,肝细胞摄入铁增加引起肝铁蓄积；肝脏铁调节蛋白1含量随着应激天数增加而增加,通过与IRE结合转录后调控铁蛋白,转铁蛋白受体1的表达可能是心理应激情况下肝铁蓄积的原因。2.连续7天每天注射10-6mol/L的皮质酮可以引起大鼠肝脏铁调节蛋白1表达上调、转铁蛋白受体1含量增加、铁蛋白减少、肝脏铁含量增加,与7天心理应激后大鼠肝脏铁代谢变化一致,结合以往研究结果提示心理应激时糖皮质激素的大量分泌可能是导致大鼠肝脏铁调节蛋白1表达增加的重要原因。3.通过整体动物和细胞实验发现,糖皮质激素可以上调铁调节蛋白1的表达。分别采用特异性糖皮质激素受体抑制剂RU486或STAT5抑制剂后,铁调节蛋白1的表达有不同程度的降低,而在培养基中同时添加上述两种抑制剂几乎可完全抑制铁调节蛋白1的表达,表明糖皮质激素可通过增强GR和STAT5信号通路上调铁调节蛋白1的表达。综上所述,心理应激时糖皮质激素大量释放,通过GR和STAT5与铁调节蛋白1基因位点上的相应DNA结合位点结合,上调铁调节蛋白1基因的表达,随着铁调节蛋白1含量的逐渐增加,与IRE结合,通过转录后调控引起转铁蛋白受体1表达增加,铁蛋白表达减少,肝细胞摄入铁增加,导致肝铁蓄积肝脏损伤。