论文部分内容阅读
猪病毒性腹泻是一种接触性的肠道传染病,其临床症状为呕吐,腹泻和脱水等。其病原包括猪博卡病毒(Porcine Bocavirus,PBCo V)、诺如病毒(Norovirus,No V)、猪Delta冠状病毒(Porcine Delta Coronavirus,PDCo V)、猪流行性腹泻病毒(Porcine Variant Diarrhea Virus,PEDV)、轮状病毒(Rotavirus,RV)和猪传染性肠胃炎病毒(Porcine Infectious Gastroenteritis Virus,TGEV)等六种病毒,该类病毒引起的临床症状、流行病学规律和病理变化非常相似,特别是猪性腹泻病毒,其变异毒株不断出现,防控技术要求更高,临床诊断时不易区分其病原体,因此建立一种同一反应、快速、灵敏的检测方法区分将有利于该类疾病的防控。本研究利用多重连接探针扩增技术(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification,MLPA)和荧光定量RT-PCR技术,分别建立区分6种病毒性腹泻病原体的MLPA检测方法和猪流行性腹泻变异毒株与疫苗毒株的荧光定量RT-PCR方法,为快速检测猪病毒性腹泻疾病的病原提供技术支持。1、检测6种猪病毒性腹泻疾病病原的MLPA技术研究MLPA是一种高通量、针对多种病原核酸中特异靶序列进行定性和定量分析的新技术。本研究利用MLPA技术,以PBCo V、No V、PDCo V、PEDV、RV、TGEV为研究对象,分别设计了针对6种病毒的MLPA探针,按照变性、退火、杂交、扩增、检测的程序,建立了同一反应、同时检测6种病毒的MLPA方法。结果表明:引物探针浓度为1.33 nmol/L时,每种病毒的探针针对其自身模板都只有单一的扩增峰,其大小与预测基本一致:PBCo V约102 bp、No V约110 bp、PDCo V约117 bp、PEDV约124 bp、RV约131 bp、TGEV约138 bp,探针具有良好的扩增效率,对其他病毒模板都没有特异的扩增峰;6种探针混合体系中针对每一种腹泻病原体只扩增出单一的扩增峰,在同一体系中同时获得6种病原的特异性峰,而针对猪场常见病毒如猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)、猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)、伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PRV)和猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus Type 2,PCV2)均为无特异性扩增峰。6种猪病的MLPA方法的最低检测限分别为:RV(75拷贝/反应)、PEDV(7.53拷贝/反应)、TGEV(7.49拷贝/反应)、PDCo V(7.54拷贝/反应)、No V(7.56拷贝/反应)、PBCo V(75.8拷贝/反应)。依据建立的MLPA检测方法,针对52份临床样品进行检测,同时设置阴性和阳性对照,结果显示:PEDV阳性率47.06%[95%CI:19.9%-26.9%],RV阳性率为1.96%[95%CI:0-10.4%],TGEV阳性率为1.96%[95%CI:0-10.4%],PEDV、RV和TGEV混合感染阳性率为1.96%[95%CI:0-10.4%],其它病毒均未检出。本研究建立的6种病毒MLPA检测方法具有一次采样、一次分析、同时检测6种猪病毒性腹泻病的目的,该方法特异性强、灵敏度高、多重性检测等优势,有望成为未来动物疫病检测的新技术。2、一步法双重荧光定量RT-PCR检测PEDV变异毒株与疫苗毒株方法的建立本研究根据Gen Bank公布的猪流行性腹泻病毒(PEDV)8株典型的变异毒株(GⅡ型)和5株疫苗毒株(GⅠ型)的S基因序列设计一对引物和两条特异探针(变异毒株携带FAM荧光基团,疫苗毒株携带HEX荧光基团),建立基于Taq Man探针的一步法双重荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示:该方法在10-1-108拷贝数/μL范围内,检测GⅡ毒株(R2=0.9892)和GⅠ型毒株(R2=0.9914)具有较好的扩增效率,Ct值与浓度之间具有较好线性关系;检测灵敏度分别为GⅡ毒株7.388拷贝数/μL、GⅠ型毒株4.322拷贝数/μL;GⅠ型和GⅡ型之间没有交叉反应,且该方法与CSFV、TGEV、RV、PRV、JEV、PPV等病原体之间没有交叉反应,特异性好;组间和组内变异系数低,重复性好;对12份临床样品通过一步RT-PCR检测方法与普通行业标准方法进行阳性值对比得出的kappa值为0.75,对12份经病毒分离鉴定为阳性的样品进行检测,12份皆为PEDV变异毒株阳性,与PEDV病毒分离结果符合率为100%。本研究建立的基于Taq Man探针的一步法双重荧光定量RT-PCR检测方法具有灵敏、特异、高通量、准确定量和基因分型等优点,可用于临床PEDV变异毒株和疫苗毒株的快速鉴别诊断。本研究建立的检测多种猪病毒性腹泻病毒的MLPA方法,同时检测出6种猪病毒性腹泻病毒病原体,具有快速、敏感度高、特异性好和可重复性高的特点,为猪病毒性腹泻病毒病原体的监测与应急诊断提供高通量检测技术。本研究双重基于Taqman探针的一步双重实时荧光定量PCR方法和普通荧光定量RT-PCR方法相比,使得检测结果更加准确、灵敏度更高,有利于鉴定临床样品中PEDV的变异毒株和疫苗毒株的流行。本研究所建立的方法为针对猪场病毒性腹泻的临床诊断、防控方案制定奠定技术基础。