【摘 要】
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本实验室已经成功构建了含重组TMP(Thrombopoietin mimetic peptide)和HSA(Human serum albumin)融合蛋白基因的表达载体 pPinkα-11#(1-3),pPinkα-15#(1-9),pPinkα-16#(1-
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本实验室已经成功构建了含重组TMP(Thrombopoietin mimetic peptide)和HSA(Human serum albumin)融合蛋白基因的表达载体 pPinkα-11#(1-3),pPinkα-15#(1-9),pPinkα-16#(1-4),并转化嗜甲醇酵母,经摇瓶培养,获得目的重组融合蛋白,表达量约为1.25g/L,但是比活仅为(300-8000)U/mg,与阳性对照TPO相比,还相差甚远。为增加融合蛋白表达量及比活,本文进一步对目的基因TMP和HSA的连接顺序、TMP二联体之间的连接肽、TMP二联体连接顺序和HSA功能结构域等分别进行了重建筛选,构建了多个酵母和哺乳动物细胞表达载体,并经过转化或转染,成功构建了稳定表达目的蛋白的工程菌株或细胞株。结果表明,在酵母表达系统中,TMP位于HSA的C端的克隆所表达融合蛋白的量高于TMP位于HSA的N端的克隆;TMP二联体间连接肽为L1的克隆生物活性高于连接肽为L2的克隆;HSA-(TMP)2中TMP二联体连接顺序为首尾相连;采用其HSA-D3结构域替代全长HSA,(TMP)2-HSA-D3重组载体整合的酵母菌株pPinkα-15#D3(2-2)所表达目的蛋白的比活为1478U/mg,显著高于(TMP)2-HSA的361U/mg;pCHO1.0-15-15-2转染CHO细胞后所表达融合蛋白比活达到16500U/mg,与嗜甲醇酵母所表达融合蛋白相比,活性显著提高。本研究对于提高或改善TMP融合蛋白表达量和活性等具有参考意义。
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