[背景]胰腺癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,具有病程短、发展迅速、转移早、确诊时间晚、缺乏特异性靶点和尚无有效治疗方法等特点,但是其具体的发病机制仍处于探索阶段。胰腺癌的发生和发展是源于长期多因素、多基因协同作用的结果。其中,KRAS是胰腺癌中突变频率最高的癌基因之一,且其突变集中于2号外显子的第12密码子。在此,值得注意的是一种特殊类型的基因突变—杂合性缺失（Loss Of Heterozygosity,LOH）,LOH是指一对杂合的等位基因演变为纯合状态的现象。本课题小组通过前期实验发现:KRASG12D-LOH存在于转基因小鼠及人类胰腺癌细胞中,即KRASG12D型胰腺癌中野生型KRAS等位基因丢失,且使肿瘤具有更强的增殖和侵袭转移能力,但是我们发现这一现象与KRASG12D本身或其下游直接功能分子的活性无明显关联性,还需通过更为深入的研究来揭示其确切机制。在前期的研究中发现,KRASG12D-LOH可通过发育及DNA损伤反应调节基因1（regulated in development and DNA damage response 1,REDD1）介导有氧糖酵解调控胰腺癌恶性表型。另外,发现胰腺肿瘤细胞对谷氨酰胺的缺乏十分敏感,表现出“谷氨酰胺依赖”现象。伴有KRASG12D-LOH的细胞株相对于不伴有LOH的KRASG12D细胞株中REDD1、HIF-2α表达更高,谷氨酰胺代谢更加旺盛,提示伴有KRASG12D-LOH的细胞株的高侵袭和转移能力与REDD1、HIF-2α介导的谷氨酰胺代谢密切相关。基于此,本课题旨在探讨KrasG12D-LOH对谷氨酰胺代谢的调控机制,重点聚焦REDD1和HIF-2α在其过程扮演的角色,分析KrasG12D-LOH介导的谷氨酰胺代谢与胰腺癌恶性生物学行为之间的关系,从能量代谢水平视角揭示KrasG12D-LOH介导胰腺癌恶性生物学行为的分子机制,以期为进一步认识胰腺癌发病机理及寻找临床诊疗新靶点提供有价值的实验理论依据。第一章KRASG12D-LOH对胰腺癌细胞谷氨酰胺代谢的影响[目的]本研究旨在研究缺氧和常氧条件下,KRASG12D-LOH对胰腺癌细胞谷氨酰胺代谢水平的调控作用。[方法]1.将胰腺癌KRASG12D-LOH细胞株（897细胞）与KRASG12D细胞株（399细胞）分别在缺氧（1%O2、5%CO2、94%N2）和常氧（5%CO2、95%空气）条件下给予培养,使用谷氨酰胺试剂盒检测细胞谷氨酰胺摄取率、ROS检测试剂盒测定细胞内ROS水平、NADP（H）含量检测试剂盒检测细胞内NADPH/NADP+比值以分析胰腺癌细胞谷氨酰胺代谢水平;2.利用Western Blot和RT-qPCR方法测定各组细胞内谷氨酰胺代谢通路中相关分子标志物的蛋白和mRNA表达情况;[结果]1.在缺氧和常氧条件下,KRASG12D-LOH细胞谷氨酰胺摄取量和NADPH/NADP+比值均明显高于KRASG12D细胞（P<0.01）,而KRASG12D-LOH细胞ROS水平明显低于KRASG12D细胞（P<0.05）。2.Western Blot结果表明,在缺氧和常氧条件下,KRASG12D-LOH细胞的谷氨酰胺代谢通路中相关分子标志物GLS1、GOT2、GOT1、MDH1和ME1蛋白表达水平相对KRASG12D细胞均显著升高（P<0.01）;RT-qPCR结果显示,KRASG12D-LOH细胞的GLS1、GOT2、GOT1、MDH1和ME1 mRNA表达水平相对KRASG12D细胞均显著升高（P<0.01）。[结论]在缺氧和常氧条件下,KRASG12D-LOH促进胰腺癌细胞谷氨酰胺代谢水平,提高谷氨酰胺代谢通路中相关分子标志物GLS1、GOT2、GOT1、MDH1和ME1的mRNA和蛋白表达水平。第二章REDD1对KrasG12D-LOH介导谷氨酰胺代谢调控胰腺癌细胞恶性表型的作用[目的]本研究旨在探究缺氧条件下,REDD1在KrasG12D-LOH型胰腺癌细胞恶性表型中的作用,以及REDD1在KrasG12D-LOH介导谷氨酰胺代谢调控恶性表型中的作用及相关机制。[方法]1.将sh-REDD1干扰慢病毒和shRNA-NC阴性对照病毒分别转染KrasG12D-LOH（897细胞株和907细胞株）和KrasG12D细胞（399细胞株和403细胞株）;将各组细胞在缺氧条件下给予培养,CCK-8细胞增殖实验和平板克隆形成实验观察REDD1对胰腺癌细胞株增殖能力的影响;利用细胞划痕实验和Transwell侵袭实验观察REDD1对KrasG12D-LOH和KrasG12D型胰腺癌细胞株迁移和侵袭能力的影响;利用流式细胞仪观察REDD1对KrasG12D-LOH和KrasG12D型各组胰腺癌细胞株细胞周期和细胞凋亡的影响。2.分别使用谷氨酰胺试剂盒检测细胞谷氨酰胺摄取率、ROS（活性氧）测试盒测定细胞中ROS含量、NADP（H）含量检测试剂盒检测细胞内NADPH/NADP+比值以分析胰腺癌细胞谷氨酰胺代谢水平。3.使用Western Blot和RT-qPCR方法,对各组细胞内谷氨酰胺代谢分子标志物GLS1、GOT2、GOT1、MDH1和ME1的mRNA与蛋白表达水平进行测定。4.应用GEPIA数据库分析胰腺癌组织中REDD1与谷氨酰胺代谢标志物GLS1、GOT2、GOT1、MDH1和ME1的mRNA表达量的相关性。[结果]1.在缺氧条件下,通过CCK-8细胞增殖实验和平板克隆形成实验结果显示:KRASG12D-LOH细胞（897细胞株和907细胞株）的sh-REDD1组细胞增殖能力较Control组和shRNA-NC组明显下降（P<0.01）;而KRASG12D细胞（399细胞株和403细胞株）的sh-REDD1组细胞增殖能力较Control组和shRNA-NC组明显增加（P<0.05）;细胞划痕实验和Transwell侵袭实验结果提示KRASG12D-LOH细胞（897细胞株和907细胞株）的sh-REDD1组的细胞迁移和侵袭能力均低于相应的Control组和shRNA-NC组（P<0.01）,而KRASG12D细胞（399细胞株和403细胞株）的sh-REDD1组的细胞迁移和侵袭能力均高于各自的Control组和shRNA-NC组（P<0.01）。细胞周期和凋亡结果发现KRASG12D-LOH细胞（897细胞株和907细胞株）sh-REDD1组的细胞S期比例显著低于Control组和shRNA-NC组（P<0.01）,细胞凋亡率与Control组和shRNA-NC组相比显著升高（P<0.01）;而KRASG12D细胞（399细胞株和403细胞株）sh-REDD1组的细胞S期比例明显高于Control组和shRNA-NC组（P<0.01）,细胞凋亡率与Control组和shRNA-NC组相比显著降低（P<0.01）。2.谷氨酰胺检测结果显示,KRASG12D-LOH细胞（897细胞株和907细胞株）的sh-REDD1组谷氨酰胺摄取量较Control组和shRNA-NC组明显下降（P<0.01）,而KRASG12D细胞（399细胞株和403细胞株）的sh-REDD1组谷氨酰胺摄取量与Control组和shRNA-NC组相比明显增高（P<0.05）;同时,KRASG12D-LOH细胞（897细胞株和907细胞株）的sh-REDD1组与Control组和shRNA-NC组相比ROS水平有所增加（P<0.05）,NADPH/NADP+比值降低（P<0.05）;而KRASG12D细胞（399细胞株和403细胞株）的sh-REDD1组同Control组和shRNA-NC组相比ROS水平明显下降（P<0.01）、NADPH/NADP+比值增加（P<0.05）。3.Western Blot和RT-qPCR结果均提示在缺氧培养条件下,KRASG12D-LOH细胞（897细胞株和907细胞株）的sh-REDD1组GOT1、GOT2和MDH1的mRNA和蛋白表达水平同Control组和shRNA-NC组相比明显下降（P<0.01）;KRASG12D细胞（399细胞株和403细胞株）的sh-REDD1组GOT1、GOT2和MDH1的mRNA和蛋白表达水平同Control组和shRNA-NC组相比有所增高（P<0.01）。4.GEPIA数据库相关性分析结果显示,在胰腺癌中,REDD1与谷氨酰胺代谢标志物GOT1、GOT2和MDH1之间存在不同程度的正相关（P<0.05）。[结论]REDD1可以调控KrasG12D-LOH和KrasG12D型胰腺癌细胞的恶性表型,且呈现不同的趋势,这一过程可通过REDD1介导的谷氨酰胺代谢调节而实现。第三章HIF-2α对KrasG12D-LOH介导谷氨酰胺代谢调控胰腺癌细胞恶性表型的作用[目的]本研究旨在探究HIF-2α在KrasG12D-LOH型胰腺癌细胞恶性表型中的作用,以及HIF-2α在KrasG12D-LOH介导谷氨酰胺代谢调控胰腺癌细胞恶性表型中的作用及相关机制。[方法]1.利用GEPIA分析HIF-2α基因在人体正常组织和其相应的肿瘤组织中表达的差异性;利用Western Blot和RT-qPCR方法检测KrasG12D-LOH和KrasG12D两种细胞的蛋白和mRNA表达水平。2.将sh-HIF-2α干扰慢病毒和shRNA-NC阴性对照病毒转染KrasG12D-LOH细胞（897细胞株和907细胞株）和KrasG12D细胞（399细胞株和403细胞株）;CCK-8细胞增殖实验和平板克隆形成实验观察HIF-2α对KrasG12D-LOH和KrasG12D胰腺癌细胞株增殖能力的影响;利用Transwell迁移和侵袭实验观察HIF-2α对KrasG12D-LOH和KrasG12D胰腺癌细胞株迁移和侵袭能力的影响;利用流式细胞仪观察HIF-2α对KrasG12D-LOH和KrasG12D各组胰腺癌细胞细胞周期和细胞凋亡的影响。3.分别使用谷氨酰胺试剂盒检测细胞谷氨酰胺摄取率、活性氧（ROS）测试盒测定细胞内ROS水平、NADP（H）含量检测试剂盒测定细胞内NADPH/NADP+比值以分析胰腺癌细胞谷氨酰胺代谢水平。4.利用Western Blot和RT-qPCR方法对各组细胞中谷氨酰胺代谢分子标志物GLS1、GOT2、GOT1、MDH1和ME1的mRNA以及蛋白表达水平进行测定。5.利用GEPIA数据库分析胰腺癌组织中HIF-2α和谷氨酰胺代谢标志物GLS1、GOT2、GOT1、MDH1和ME1的mRNA表达量的相关性。6.构建了小鼠皮下胰腺癌移植瘤模型开展体内研究,对小鼠重量与瘤体大小进行记录,剥离瘤体并称重;应用免疫组化Ki67染色阳性细胞数对各组肿瘤的增殖情况进行评估;利用Western Blot和RT-qPCR测定各组肿瘤组织的谷氨酰胺代谢通路相关分子标志物c-myc、GOT1的表达情况。[结果]1.与正常组织相比,胰腺癌组织中HIF-2α的mRNA水平呈高表达状态（P<0.05）;Western Blot和RT-qPCR提示,KRASG12D-LOH细胞（897细胞株和907细胞株）HIF-2α的蛋白和mRNA水平均高于KrasG12D细胞（399细胞株和403细胞株）。2.由CCK-8细胞增殖实验和平板克隆形成实验结果显示:897细胞株、907细胞株、399细胞株和403细胞株的sh-HIF-2α组细胞增殖能力较各自Control组和shRNA-NC组有所下降（P<0.05）;Transwell迁移和侵袭实验结果发现与Control组和shRNA-NC组相比,各组细胞株的sh-HIF-2α组细胞迁移和侵袭能力均显著下降（P<0.01）;细胞周期和凋亡结果提示各组细胞株sh-HIF-2α组的细胞S期比例均低于Control组和shRNA-NC组（P<0.01）,细胞凋亡率高于Control组和shRNA-NC组（P<0.01）。3.谷氨酰胺检测结果显示,KRASG12D-LOH细胞（897细胞株和907细胞株）的sh-HIF-2α组谷氨酰胺摄取量较Control组和shRNA-NC组明显下降（P<0.01）;而KrasG12D细胞（399细胞株和403细胞株）sh-HIF-2α组谷氨酰胺摄取量较Control组和shRNA-NC组无明显变化（P>0.05）;同时,KRASG12D-LOH细胞（897细胞株和907细胞株）和KrasG12D细胞（399细胞株和403细胞株）的sh-HIF-2α组较Control组和shRNA-NC组ROS水平有所增加（P<0.05）,NADPH/NADP+比值降低（P<0.05）。4.Western Blot和RT-qPCR结果均提示,KRASG12D-LOH细胞（897细胞株和907细胞株）sh-HIF-2α组的c-myc和GOT1的蛋白和mRNA表达水平,与Control组和shRNA-NC组相比,sh-HIF-2α组明显下降（P<0.05）。5.GEPIA数据库分析HIF-2α与谷氨酰胺代谢标志物相关性结果显示,在胰腺癌中,HIF-2α与谷氨酰胺代谢标志物GLS1、GOT1、GOT2、MDH1和ME1之间存在不同程度的正相关（P<0.01）。6.小鼠皮下胰腺癌移植瘤模型实验结果显示,897细胞株sh-HIF-2α组瘤重和瘤体体积较shRNA-NC组有所下降（P<0.01和P<0.01）,同时,399细胞株sh-HIF-2α组瘤重和瘤体体积较shRNA-NC组也有所下降（P<0.05和P<0.05）。897细胞株sh-HIF-2α组Ki67阳性细胞数较shRNA-NC组明显下降（P<0.01）。399细胞株sh-HIF-2α组Ki67阳性细胞数较shRNA-NC组也有所下降（P<0.01）。RT-qPCR结果显示,897细胞株sh-HIF-2α组细胞的HIF-2α、c-myc和GOT1 mRNA相对表达量较shRNA-NC组显著降低（P<0.01、P<0.01和P<0.01）;Western Blot结果显示,与shRNA-NC组相比,897细胞株sh-HIF-2α组HIF-2α、c-myc和GOT1蛋白表达水平（P<0.01、P<0.01和P<0.01）显著降低。[结论]HIF-2α在调控KrasG12D-LOH和KrasG12D型胰腺癌的恶性表型方面具有重要作用,其可能参与谷氨酰胺代谢的调节。