第一章质谱技术鉴定组织型激肽释放酶脑相关蛋白　　[目的]　　为进一步阐明组织型激肽释放酶(Tissue kallikrein,TK)的脑保护机制,采用质谱技术鉴定出TK的脑相关蛋白。　　[方法]　　1.分别采用两种方法获得差异蛋白进行质谱分析:其一,为寻找Neuro-2a细胞膜上与TK相关的蛋白,分别将包含全长、无信号肽的TK基因质粒(GFP-TK-full和GFP-TK-no)转染至Neuro-2a细胞,转染24～36h以后,生物素标记Neuro-2a细胞膜,细胞裂解液用兔源性抗GFP抗体进行免疫共沉淀,然后用特异性识别生物素的链亲和素-辣根过氧化物酶进行检测;其二,将纯化的TK蛋白与大鼠脑组织抽提上清液混匀作用,用兔源性抗TK抗体或IgG进行免疫共沉淀,裂解蛋白进行SDS-PAGE电泳银染;　　2.将上述电泳所得差异蛋白切胶酶解打质谱,并将数据进行相关处理;　　3.RT-PCR检测缺氧再复氧的Neuro-2a细胞中,内源性差异蛋白在TK(10,100,1000 nM)处理后的表达变化,筛选出可能与TK相关的蛋白。　　[结果]　　1.生物素标记结果显示:GFP-TK-full转染组较GFP-TK-no和GFP两转染组出现两条差异蛋白条带,分子量分别为64kDa和49kDa;　　2.TK纯化蛋白与大鼠脑组织作用后结果显示:用抗TK抗体免疫共沉淀后有一条差异蛋白,分子量约为64kDa;　　3.质谱鉴定出19种差异蛋白;　　4.TK浓度依赖性上调Homerlb/c和Flotillin-2的mRNA表达。　　[结论]　　质谱鉴定结果显示与TK相关的脑蛋白分子量大约在40～65kDa之间。TK的作用机制很可能与Homerlb/c和Flotillin-2两者有关,我们将把Homerlb/c作为研究TK作用机制的靶蛋白。　　第二章组织型激肽释放酶在缺氧诱导的Neuro-2a细胞损伤中通过Homer发挥抗凋亡作用　　[目的]　　阐明TK在缺氧诱导的Neuro-2a细胞损伤中通过Homerlb/c发挥其抗凋亡作用。　　[方法]　　1.构建小鼠pcDNA3.1-Homerlb/c质粒,合成针对小鼠Homerlb/c特定序列的siRNA,并分别将其转染至Neuro-2a细胞,上调及下调Homerlb/c的表达,RT-PCR和western-blot分别检测转染后Homerlb/c的mRNA和蛋白水平;　　2.分别上调及下调Neuro-2a细胞中Homerlb/c的表达,CCK-8方法测定细胞的存活率,LDH释放、caspaSe-3活性及Hochcst染色检测细胞凋亡,观察Homerlb/c在Neuro-2a细胞缺氧损伤中的作用;　　3.RT-PCR和western-blot分别检测缺氧复氧后不同时间点,TK(100 nM)孵育后Homerlb/c的mRNA和蛋白表达;激光共聚焦观察Homerlb/c在缺氧及TK作用下的表达及定位;　　4.分别上调及下调Neuro-2a细胞中Homerb/c的表达,并予细胞缺氧和TK干预,CCK-8方法测定细胞的存活率,LDH释放、caspase-3活性及Hochcst染色检测细胞凋亡,观察TK的抗凋亡作用是否与Homerlb/c有关;　　5.在上述条件下,western-blot检测ERKl/2、P38、JNK、Akt、GSK3β的磷酸化水平,激光共聚焦观察磷酸化的ERKl/2的表达,western-blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达,研究TK与Homerlb/c及其下游信号通路间的关系;　　6.过表达Homerlb/c,PD98059和LY294002分别抑制ERKl/2和P13K信号通路,CCK-8方法测定细胞的存活率,LDH释放量检测细胞凋亡,观察Homerlb/c在缺氧细胞中的作用与下游信号通路间的关系。　　[结果]　　1.peDNA3.1-Homerlb/c和Homerlb/c siRNA转染Neuro-2a细胞后,Homerlb/e的表达(mRNA和蛋白表达)分别明显上调及下调;　　2.Homerlb/c在Nero-2a细胞缺氧损伤中有抗凋亡作用:上调Homerlb/c的表达提高了细胞生存率,降低了细胞LDH释放、caspase-3活性及Hochest染色凋亡细胞数目;而下调Homerlb/c后与上述效应相反;　　3.TK上调Neuro-2a细胞缺氧复氧损伤中Homerlb/c的mRNA和蛋白表达,及促进Homerlb/c的膜转位;　　4.TK在Neuro-2a细胞缺氧损伤中通过Homerlb/c起抗凋亡作用:上调Homerlb/c,同时给予细胞缺氧和TK干预,发现细胞生存率明显提高,细胞LDH释放、caspase-3活性及Hochest染色凋亡细胞数目降低,提示Homerlb/c的过表达促进了TK的抗凋亡作用;相反,发现下调Homerlb/c后抑制了TK的抗凋亡作用;　　5.TK通过Homerlb/c激活下游信号通路:在缺氧条件下,TK明显增高了ERKl/2、Akt、GSK3β的磷酸化水平;而下调Homerlb/c后发现,TK的该促磷酸化作用明显降低;激光共聚焦实验显示,上调及下调Homerlb/c后,分别提高及降低了TK的促磷酸化作用;　　6.TK可能通过Homerlb/c促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,而抑制促凋亡蛋白Bax的表达:在缺氧条件下,TK明显提高了Bcl-2的表达,降低了Bax的表达;而下调Homerlb/c后,TK的促Bcl-2表达的作用明显降低,Bax的表达明显增高;　　7.Homerlb/c通过ERKl/2和P13K信号通路起抗凋亡作用:上调Homerlb/c的表达,予细胞缺氧刺激,PD98059和LY294002均抑制了Homerlb/c过表达后的抗凋亡作用。　　[结论]　　在Neuro-2a细胞缺氧损伤中,TK通过上调Homerlb/c的表达激活ERKl/2和PI3K-Akt-GSK3β信号通路,而发挥其抗凋亡作用。此外,上调Homerlb/c的表达抑制了缺氧诱导的细胞凋亡。　　第三章缺氧及酸诱导Neuro-2a细胞中Homer的表达变化及其机制的研究　　[目的]　　探讨缺氧及酸处理诱导Neuro-2a细胞中Homer的表达变化及其机制。　　[方法]　　1.缺氧或酸处理再灌注后不同时间点,RT-PCR和western-blot分别检测Homerla、1b/c的mRNA和蛋白表达;持续缺氧或持续酸处理不同时间点,RT-PCR检测Homerla的mRNA表达,观察缺氧或酸处理对Homer表达变化的影响;其中,在酸处理组均加入谷氨酸受体抑制剂CNQX和MK801、电压门控钙通道阻断剂尼莫地平,阻断经典钙通道显示ASICs的活性,以下实验相同;　　2.持续缺氧或持续酸处理不同时间点,CCK-8方法检测细胞存活率,LDH释放检测细胞凋亡,观察两种刺激对细胞功能的影响;　　3.持续缺氧或持续酸处理不同时间点,western-blot检测ERKl/2和Akt的磷酸化水平,观察两种刺激对细胞信号通路的影响;　　4.给予细胞缺氧和ERKl/2抑制剂PD98059处理,RT-PCR检测Homerla、1b/c的表达,观察缺氧诱导的Homer的表达变化是否与ERKl/2信号通路有关;给予细胞酸、PD98059和PI3K抑制剂LY294002处理,RT-PCR检测Homerla、1 b/c的表达,观察酸诱导的Homer的表达变化是否与ERKl/2和PI3K-Akt信号通路有关;给予细胞酸、ASICla特异及非特异抑制剂PcTX和盐酸阿米洛利(amiloride)、钙离子螯合剂EGTA,RT-PCR捡测Homerla、1b/c的表达,观察酸诱导的Homer的表达变化是否与ASICla介导的Ca2+内流有关。　　[结果]　　1.缺氧或酸处理再灌注后均可诱导Homerla的mRNA和蛋白表达上调;持续缺氧或持续酸处理均在刺激后3h Homerla的表达至最高峰,且酸较缺氧处理诱导的Homerla的表达更高且持久;　　2.持续缺氧或持续酸刺激,细胞生存率逐渐降低,LDH释放逐渐增加,且酸较缺氧处理导致细胞损伤更严重;　　3.持续缺氧或持续酸刺激,细胞ERKl/2和Akt的磷酸化水平动态改变,均在刺激后30 min表达最高;　　4.PD98059抑制了缺氧诱导的Homerla mRNA的表达上调;PD98059和LY294002分别抑制了酸诱导的Homerla mRNA的表达上调;PcTX、amiloride和EGTA分别抑制了酸诱导的Homerla mRNA的表达上调。　　[结论]　　缺氧及酸均可诱导Neuro-2a细胞中Homerla的mRNA和蛋白表达上调。缺氧上调Homerla的mRNA表达通过ERKl/2信号通路;酸上调Homerla的mRNA表达通过ERKl/2、PI3K-Akt信号通路及ASICla介导的Ca2+内流途径。而且,酸较缺氧处理诱导Homerla的表达更高且持久,细胞损伤更严重,且通过多条信号通路上调Homerla的表达,表明酸处理可能通过更加复杂的机制激活胞内的信号通路导致Homerla的诱导表达及细胞损伤。