严重的皮肤缺损，如大面积的深度烧伤等，伤及皮肤全层及其附属器，仅靠创面自身难以实现皮肤再生，需要足够的皮肤替代物进行修复。目前构建的表真皮双层组织工程皮肤虽已应用于临床，基本解决了创面覆盖的问题，但未达到真正的皮肤组织结构和功能的完全重建，其最大的问题是缺乏皮肤附件，如皮脂腺、汗腺等附属器。表皮干细胞(Epidermal stem cell，ESC)是皮肤组织特异性干细胞，位于表皮基底层，在维持表皮更新，保持细胞恒定等方面起着重要作用。表皮干细胞具有多向分化潜能，体内证实能够向皮肤附属器及表皮分化。若能在体外诱导表皮干细胞向汗腺分化，将为研究带汗腺的组织工程皮肤提供重要实验依据。　　本研究拟采用Ⅳ型胶原快速粘贴法和双标法体外分选原代表皮干细胞，比较不同的传代消化方法对ESC的影响，筛选出最佳的ESC传代培养方法。利用新的传代培养方法，比较原代细胞及传代细胞的生物学差异，筛选出合适的人表皮干细胞。从具有诱导上皮细胞向凝胶中生长的细胞外基质和影响细胞生长与发育的培养条件因素入手，将表皮干细胞接种到复方壳多糖真皮基质上和胶原凝胶中，加入层粘连蛋白和纤维粘连蛋白，提高EGF浓度，体外垂直震荡培养，进行三维培养和定向诱导分化，采用HE染色、免疫荧光、透射电镜、激光共聚焦等手段观察表皮干细胞定向分化为汗腺样上皮的形态及表型改变，探讨表皮干细胞定向分化为汗腺样上皮细胞的证据和影响因素，为研究带汗腺的组织工程皮肤的条件摸索提供可靠实验依据。　　第一部分体外人表皮干细胞的培养研究　　一、目的：　　筛选出合适的人表皮干细胞，以便用于组织工程皮肤的三维培养。　　二、方法：　　首先，从包皮标本获得原代的表皮干细胞，比较0.25％胰蛋白酶、0.25％胰蛋白酶＋0.01％EDTA常规消化和0.25％胰蛋白酶、0.25％胰蛋白酶＋0.01％EDTA、0.25％中性分离酶不同消化时间的冷消化方法对ESC的影响，通过比较细胞黏附率、活细胞数、细胞活力、传代次数及形态变化等指标，确定最佳的体外消化传代ESC的方法。然后进行传代培养，采用CASY?系统计算各代细胞的粘附率，倒置相差显微镜下观察原代干细胞及传代细胞的形态学变化，观察干细胞表面标志物整合素β1、CK19，细胞分化的表面标志物CK10的表达情况，以及各组细胞基因组的表达差异，比较原代ESC与传代细胞的生物学特性差异。　　三、结果：　　0.25％胰蛋白酶冷消化4小时在消化后细胞活力、细胞黏附率、细胞生长状态、细胞传代次数上较传统方法效果好。随着传代次数的增加，干细胞的粘附率逐渐降低，细胞生长融合时间增加，各组细胞均表达整合素β1，原代、2代及4代细胞表达CK19，但6代细胞不表达CK19，6代细胞部分表达CK10.原代及4代细胞基因组比较结果相近，但与6代细胞结果差异较大。　　四、结论：　　0.25％胰蛋白酶冷消化4小时为最佳的人ESC消化传代方法。体外培养的人表皮干细胞宜选用4代以前的细胞。　　第二部分表皮干细胞向汗腺样上皮分化条件的初步研究　　一、目的：　　寻找表皮干细胞向汗腺样上皮分化的影响条件并对诱导成的管腔样结构进行鉴定。　　二、方法：　　1、从包皮中分离人成纤维细胞建立成纤维细胞库，用细胞库中的成纤维细胞构建组织工程真皮，利用第一部分的传代方法获得人表皮干细胞1代，将1代ESC接种在组织工程真皮上构成组织工程皮肤。　　2、体外垂直震荡培养，加入不同浓度的层粘连蛋白、纤维粘连蛋白和EGF，寻找表皮干细胞定向分化为汗腺样上皮的相关培养条件。　　3、将1代表皮干细胞接种在组织工程胶原凝胶中，利用上述优选的分化条件进行诱导分化，采用HE染色、免疫荧光、透射电镜观察所诱导结构的形态学及组织学特性。　　4、采用钙荧光探针Fluo-3对管腔样结构进行荧光染色，分别在管腔样结构中适时加入钙离子激动剂(氯化乙酰胆碱)和阻滞剂(阿托品)，激光共聚焦观察其细胞内游离钙离子浓度的变化，对出现的管腔样结构进行功能学的鉴定。　　三、结果：　　不同浓度的层粘连蛋白和纤维粘连蛋白未能诱导出表皮干细胞向真皮基质中生长，15-20ng/ml的EGF可诱导组织工程真皮上的表皮干细胞向真皮内生长并可出现腺样结构。将1代表皮干细胞接种在组织工程凝胶中，观察到表皮干细胞同样出现管腔样结构，HE染色示其为单层细胞连接为环状结构，中间见明显的腔隙，胞质嗜酸性。透射电镜下细胞内含有分泌样颗粒和线粒体，细胞有指状突起，细胞之间存在细胞连接以及类似分泌小管的腔隙。利用CK19荧光染色，在激光扫描共聚焦显微镜下观察到细胞团中央有管腔结构，同时此结构表达CK18、CEA。细胞外液钙浓度高时，加入氯化乙酰胆碱后，细胞外钙内流，细胞内钙浓度明显增加；细胞外液　　钙浓度高时，若先加入阿托品后再加入氯化乙酰胆碱，细胞内钙浓度无明显变化。　　四、结论：　　体外培养的表皮干细胞接种在组织工程真皮上，在一定浓度的EGF诱导下，能形成管腔样结构，EGF是影响表皮干细胞向汗腺样上皮分化的重要细胞因子；所形成的管腔样结构，在形态学、组织学及功能上与在体汗腺分泌部细胞有一定的相似性。