PhFT/PhMFT家族基因调控蝴蝶兰开花的分子机制研究

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蝴蝶兰为兰科蝴蝶兰属(Phalaenopsis)花卉,因其花姿优雅,花色丰富、花期长,素有“洋兰皇后”之称。由于春节期间是蝴蝶兰的销售旺季,因此蝴蝶兰的花期调控对其经济价值具有十分重要的影响。目前蝴蝶兰花期调控主要通过温度调节来实现。由于该方法对设备要求较高而成本较大,因此探明蝴蝶兰开花机理以改进蝴蝶兰花期调控技术、降低成本尤为重要。FT(Flowering Locus T)基因作为开花途径整合子,对植物成花转变具有重要影响。本实验室前期在蝴蝶兰基因组数据库中检索到7个FT-like家族基因和1个MFT-like家族基因,其中PhFT1,PhFT5,PhFT6和PhMFT已成功克隆并获得了拟南芥转基因植株。本研究将对其余4个PhFT基因(PhFT2,PhFT3,PhFT4和PhFT7)进行克隆和拟南芥转化,并对除PhFT7外的7个PhFT/PhMFT家族基因进行时空表达分析和转基因拟南芥表型分析,以明确调控蝴蝶兰开花的关键基因,并利用拟南芥突变体(ft-10、tfl1-11)遗传转化进行关键基因功能验证。此外,通过酵母杂交试验、双荧光素酶试验和瞬时表达等试验对PhFT/PhMFT关键基因调控蝴蝶兰开花的分子机制进行探究。主要结果如下:1.从蝴蝶兰品种‘第一名’中克隆得到PhFT2和PhFT4,其序列长度分别为519 bp和534 bp;从蝴蝶兰品种‘冰激凌’中克隆得到PhFT3和PhFT7,其序列长度分别为531bp和861bp,其中PhFT7编码序列提前终止,不能正常翻译并失去功能;根据外部形态与切片组织学特征,将蝴蝶兰花芽分化进程分为成花诱导阶段、花序分生组织形成阶段、花分生组织形成阶段和花器官发育阶段。以蝴蝶兰杂交品种‘第一名’为材料,分析了 7个PhFT/PhMFT基因的时空表达模式,其中PhFT1,PhFT3,PhFT5和PhMFT在不同分化阶段的花器官中表达量显著上调;PhFT6在花芽分化进程中表达量显著下降。2.分别构建了PhFT2,PhFT3,PhFT4基因的过表达载体,利用农杆菌介导法将3个基因转入拟南芥获得转基因植株。结合本实验室前期研究,对7个PhFT/PhMFT基因的高表达转基因拟南芥株系进行表型分析。结果表明,与野生型相比,转PhFT3和PhMFT基因株系极显著地促进开花;转PhFT6基因极显著抑制开花,表明PhFT3,PhFT6和PMFT为开花关键基因。利用拟南芥突变体对关键基因功能进行验证,发现PhFT3和PhMFT均能够在一定程度上恢复ft-10的晚花表型,PhFTT6能够恢复tfl1-11的早花表型,且基因表达分析结果与开花时间结果一致。3.通过亚细胞定位、酵母杂交试验、双荧光素酶试验和蝴蝶兰瞬时转化试验对PhSVP与PhFT/PhMFT家族关键基因的相互作用进行分析,结果表明PhFT3,PhFT6,PhMFT和PhSVP主要定位于细胞核;酵母单杂交结果显示PhSVP能够与PhFT3,PhFT6和PhMFT启动子结合,其中PhFT3 启动子结合位点为起始密码子(ATG)上游-600 bp,PhFT6为-1781 bp和-344 bp,PhMFT为-2070 bp和-1059 bp;双荧光素酶试验表明PhSVP蛋白能够作为转录抑制因子与PhFT3,PhFT6和PhMFT启动子结合;在蝴蝶兰中瞬时转化PhSVP基因能够引起PhFT3,PhFT6和PhMFT表达量下降,验证了PhSVP对PhFT/PhMFT家族关键基因的抑制作用。
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