研究背景随着工业化进程加剧、环境污染、吸烟、职业接触、人口老龄化、营养失衡等因素的持续影响,肺癌的发病率和死亡率逐年升高,已经跃居恶性肿瘤之首。过去几十年来,肺癌的治疗取得了一定进展,欧美地区男性肺癌患者的死亡率甚至略有下降。但是,由于缺乏有效的早期筛查手段和化疗药物不耐受、诱导耐药等问题的存在,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者的五年生存率仍不足15%,大部分患者死于确诊后1年。肺癌的治疗已经到了一个瓶颈阶段。如何早期诊断肺癌,如何寻找肺癌化疗过程中诱导耐药的关键机制,是目前迫切需要解决的问题。Hippo通路是近年来在果蝇体内首次发现的一条新的细胞信号传导通路,该通路参与细胞间接触性抑制的调节,并且调节细胞增殖和凋亡之间的平衡,从而来调控器官的体积大小。Hippo通路的主要组成成分包括四个部分：Wts(又称lats)、Hpo、Sav(又称shar-pei)、Mats。该通路通过下调果蝇凋亡抑制蛋白1(Drosophila inhibitor of apoptosis protein1, DIAP1)、bantam、细胞周期调节因子(Cyclin E, CycE)等的表达来维持细胞增殖和凋亡之间的平衡。Yes相关蛋白(yes-associated protein, YAP)于1994年首次发现并命名,是一种多功能的细胞内连接蛋白和转录共激活因子,在正常机体细胞内发挥着信号转导和基因转录调节的作用。YAP是Hippo通路中的核心效应因子,它衔接Hippo通路和其下游的生理效应。近年研究发现,Hippo通路的调控异常出现在多种肿瘤的发生过程中。有报道YAP在肝癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、食道癌等多种肿瘤组织和肿瘤细胞株中过度表达,并且与肿瘤的转移、预后等相关,推测其可能作为致癌因子参与了肿瘤的发生和发展。有学者发现细胞密度可以通过Hippo通路来抑制转录共激活因子YAP；而Wts (Lats)肿瘤抑制蛋白激酶的磷酸化则可以导致YAP失活,并且磷酸化失活的YAP在体内促进细胞增殖的作用会减弱。反之,YAP的过表达会使细胞克服接触抑制的特性而过度增殖。有研究发现YAP在肝癌中的高表达与患者血清AFP的含量水平以及肿瘤细胞的分化程度相关,是肝癌患者总生存率和无病生存率的一个独立的预后指标。而Zhang等发现YAP能增强卵巢癌细胞株的转化表型,并且可以诱导卵巢癌对化疗产生抵抗和耐药；YAP表达增强提示患者预后不良。从以往的研究中我们知道,细胞对化疗药物的敏感程度依赖于功能p73基因的活性,而c-Jun通过稳定p73基因来促进顺铂治疗后的细胞凋亡。Danovi等证实在c-Jun所介导的顺铂所诱发的细胞凋亡中,YAP是新的和关键的下游效应因子。YAP通过与E3泛素蛋白连接酶竞争来稳定p73,从而促进细胞凋亡。综上所述,YAP在多种肿瘤组织和肿瘤细胞株中表达增强,并与肿瘤的分期、转移、化疗敏感性、预后等相关,提示它有可能是重要的癌基因,可能在肿瘤发生和发展中发挥着重要作用。但是,也有个别报导认为,YAP在乳腺癌的发生中可能发挥了抑癌基因的作用。因此,本研究旨在观察YAP在NSCLC中的表达情况以及与NSCLC分期、分级、分化、转移等的相关性,推测其在NSCLC发生、发展中可能发挥的作用和机制。研究目的1.免疫组化技术检测YAP在NSCLC组织中的表达情况；2. Western Blot技术检测YAP在NSCLC组织中的表达情况；3. RT-PCR技术检测YAP在NSCLC组织中的表达情况；4.观察YAP在不同年龄、性别、不同病理类型、不同分期和分级的NSCLC中的表达情况,统计学分析其相关性,推测YAP在肿瘤发生、发展中的可能作用和机制。研究方法1.选取2009年1月～2010年1月山东省立医院胸外科手术治疗的原发性肺癌患者40例,均未接受过化疗或放疗。2.分别取肿瘤组织标本和距肿瘤可视边界2cm以上区域的癌旁组织标本各125mmm3,立即放入-80。冰箱保存备用。3.40例患者中,男28例,女12例；患者年龄40-75岁,中位年龄57岁。4.根据国际抗癌联盟(UICC)2002年修订的肺癌分期标准,Ⅰ期17例(Ⅰa4例,Ⅰb13例),Ⅱ期12例(Ⅱa1例,Ⅱb11例),Ⅲ期11例(Ⅲa8例,Ⅲb3例)；其中Tl期5例,T2+T3+T4期35例；5.根据病理学分型鳞癌18例,腺癌20例,鳞腺癌1例,大细胞癌1例；6.根据有无淋巴结转移分为N018例,N112例,N210例；7.根据分化程度,高分化4例,中分化29例,低分化7例；8.该研究所有程序符合山东省立医院负责人体试验委员会所制定的伦理学标准,并得到该伦理委员会的批准；9.免疫组化技术检测YAP在NSCLC组织中的表达情况9.1标本经4%福尔马林固定、逐级脱水、石蜡包埋后做病理切片,切片厚度为4umm；9.2放入3%H２02中室温20分钟以去除内源性过氧化物酶；PBS液浸泡,每次5分钟,连续3次；9.3滴加封闭血清,37℃孵育30分钟；9.4每张切片滴加20ul用PBS稀释的小鼠抗人YAP—抗(1：200、上海瑞齐生物科技有限公司),阴性对照切片只滴加相同剂量的PBS溶液；9.54℃冰箱孵育过夜,次日37℃孵育30分钟；PBS(PH7.4)清洗3次,每次5分钟；9.6每张切片滴加20ulPBS稀释的HRP偶联羊抗小鼠二抗(1：200稀释、北京中杉金桥生物技术有限公司)；PBS清洗3次,每次5分钟；9.7滴加二氨基联苯胺(DAB)显色液(北京中杉金桥生物技术有限公司),镜下控制显色时间；PBS冲洗,苏木素对胞核复染；逐级酒精脱水；中性树胶封片。9.8每张切片选取5个×400视野,应用Leica QwinV3图像分析系统,计算每一视野阳性表达区域的平均灰度值。10. Western Blot技术检测YAP在NSCLC组织中的表达情况10.1应用SDS裂解液(1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF(苯甲基磺酰氟)：PMSF0.174g,异丙醇100ml,溶解后分装于1.5ml离心管中,-20℃保存)从新鲜NSCLC组织中提取总蛋白;10.2每个样本取30ug总蛋白经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并转移至PVDF膜(GE Healthcare)上;10.3YAP蛋白检测用小鼠抗人YAP单抗(1：500稀释；上海瑞齐生物科技有限公司)β-actin蛋白作为内参照。10.4DAB显色后TotallabTL120凝胶分析系统计算各样本条带的积分光密度(10D),计算YAP蛋白的相对量。11.RT-PCR技术检测YAP在NSCLC组织中的表达情况11.1应用RNAiso PLUS试剂盒(TaKaRa公司,中国)从每一样本(约50mg)提取总RNA；11.2应用PrimeScript1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa公司,中国)进行反转录；11.3应用Premix Taq Version2.0kit进行PCR扩增。体系容量为20ul,反应条件：94℃3分钟预变性,94℃30秒,64℃30秒,72℃60秒；共30个循环,72℃,60秒。β-actin作为内参照。11.4YAP与β-actin的引物序列分别是：YAP forword:5’-AACTCGGCTTCAGCCATGA-3’ YAP reverse:5’-GCTACGCAGGGCTAACTCCTGT-3’ β-actin forword:5’-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3’ β-actin reverse:5’-CACCTTCTACAATGA GCTGCGTGTG-3’11.5扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳,相对表达水平通过Totallab TL120凝胶分析系统计算。12.应用Statvie4.5统计学软件(SAS Institute, NC, USA.)进行统计学分析,所有计数资料均采用均数±标准差的方式表达,YAP表达与患者的临床病理因素的相关性分析采用卡方检验,其他数据采用t检验；以P<0.05为有统计学意义。研究结果1.免疫组化技术观察YAP在NSCLC组织中的表达YAP主要在细胞核内表达,仅很少部分在细胞浆内表达。40例NSCLC肿瘤组织中70.0%(28/40) YAP阳性,其中32.5%(13/40)强阳性,37.5%(15/40)弱阳性。而正常肺组织仅7.5%(3/40)阳性,其YAP主要在肺泡Ⅱ型上皮细胞的胞核呈灶性表达。2. Western Blot技术观察YAP在NSCLC组织中的表达观察结果显示,癌组织中YAP mRNA水平显著高于相应正常肺组织,而且这种表达升高在腺癌更为显著。3. RT-PCR技术观察YAP在NSCLC组织中的表达40例NSCLC癌组织中YAP蛋白表达相对升高的有28例,而且YAP在腺癌的表达上调更为显著。这表明YAP在NSCLC表达显著增加,而且是与基因转录水平上调有关。4.NSCLC中YAP表达与患者临床病理类型的关系进一步分析NSCLC患者YAP免疫组化结果与临床病理因素的关系,发现YAP表达强度与肿瘤的T期、TNM分期和淋巴结转移程度相关,有淋巴结转移者较未发生转移者表达显著增强(P=0.0134)；T期、TNM分期晚者,YAP表达增加(P=0.0117,P=0.0385)；这表明YAP参与NSCLC的进展过程。YAP表达与患者年龄、性别等无相关性,与肿瘤分化程度亦无相关性,不同分化程度的肿瘤组织表达强度可以相同,相同分化程度的肿瘤组织表达强度可以不同。与RT-PCR法和Western Blot法结果相似的是,腺癌较鳞癌的阳性率高(P=0.0415)；研究结论1.从mRNA水平发现YAP在NSCLC癌组织中表达水平显著高于相应的癌旁组织,这种表达升高在腺癌更为显著。2.YAP在NSCLC表达显著增加,而且是与基因转录水平上调有关。3.YAP主要在细胞核内表达,仅很少部分在细胞浆内表达。而正常肺组织仅少数呈灶性表达在肺泡Ⅱ型上皮细胞的细胞核。4.YAP的表达强度与年龄、性别、肿瘤细胞分化程度等无关,而与肿瘤T期、TNM分期、淋巴结转移等正相关。5.YAP可能参与了NSCLC的发生和发展,有可能是NSCLC形成的早期标志之一。6.应用免疫组化技术等检测YAP蛋白在NSCLC的表达,有可能成为临床评价NSCLC形成的重要分子生物学指标。