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癌症作为仅次于心血管疾病的全世界第二大人类死亡因素。而随着全球科学技术的发展因传染性疾病导致的死亡人数减少和寿命的延长,癌症有可能成为人类更大挑战。生物靶向治疗是治疗肿瘤的重要方法。转录因子FOXM1参与刺激细胞增殖,增强DNA损伤修复,促进癌细胞的转移,并且已显示抑制FOXM1可预防多种癌症的发生和发展。目前FOXM1作为抗肿瘤靶标已得到认可。在细胞周期中FOXM1的N末端能够与FOXM1的C末端结合作为抑制结构域,也能够与MuvB复合物的LIN9结合调节FoxM1的活性。FOXM1通过N末端与SMAD3相互作用,促进SMAD3核转位,促进肿瘤的转移。在本研究中,M1-138作为抗肿瘤肽,通过替换全长FOXM1的N末端与FOXM1的C末端或LIN9互作阻断FOXM1直接和间接的启动子结合机制;通过替换全长FOXM1可竞争性抑制FOXM1与SMAD3之间相互作用,从而抑制FOXM1和SMAD3的转录活性,显示出有效的抗肿瘤能力。聚精氨酸(Arg)9是一种用于细胞内递送大分子的强力载体,可以将治疗剂转运细胞膜。本研究的目的是构建M1-138抗肿瘤肽并研究其对肿瘤细胞的作用,期望为抗癌治疗提供潜在的新方法。本文的主要研究内容及结果如下:(1)采用荧光倒置显微镜检测R9穿膜肽携带GFP可以高效进入细胞并广泛分布于细胞质和细胞核。同时WB技术分析M1-138进入细胞情况,实验表明M1-138能有效进入细胞且在细胞内至少保留48 h。同时运用CCK-8发现M1-138对各肿瘤细胞(MCF-7、231、A549、HepG2和Hela细胞)增殖均有抑制作用,M1-138对231细胞活性抑制率明显高于MCF-7细胞。(2)运用qRT-PCR和WB证实231细胞中FOXM1的mRNA和蛋白水平显著高于MCF-7细胞,且231细胞对同一浓度M1-138细胞敏感性显著高于MCF-7细胞。构建转录因子FOXM1高表达细胞株M1,CCK-8检测M1和MCF-7对于M1-138的抑制作用,发现M1-138对M1细胞具有更显著的抑制效果。表明M1-138对肿瘤细胞FOXM1高表达细胞活性抑制作用明显高于FOXM1低表达的肿瘤细胞。以上结果显示M1-138对肿瘤细胞的抑制作用与转录因子FOXM1的表达水平正相关。(3)运用Transswell,单克隆形成和裸鼠实验检测了M1-138对肿瘤细胞的迁移,增殖和致瘤能力的影响,结果发现M1-138对肿瘤细胞的迁移,增殖和致瘤能力均有抑制作用。(4)通过免疫组化实验再次证实M1-138能够有效进入细胞且主要进入细胞核,与转录因子FOXM1在核内发挥作用位置一致。通过pulldown实验证实M1-138与FOXM1互作,且与FOXM1的激活结构域C末端(688-748aa)直接结合。通过荧光素酶检测发现M1-138显著影响转录因子FOXM1的直接和间接的启动子结合机制,降低其转录活性。以上结果表明M1-138可能是通过结合FOXM1的激活结构域C末端从而抑制其转录活性,抑制癌细胞的增殖、迁移及致瘤能力。(5)Pulldown实验结果显示M1-138与SMAD3直接互作,通过Pulldown实验进一步检测了M1-138能够竞争性抑制FOXM1与SMAD3的相互作用。同时通过荧光素酶检测发现M1-138抑制SMAD3转录活性。综上所述,M1-138既抑制FOXM1转录活性也抑制SMAD3转录。(6)通过定量PCR和WB检测FOXM1和SMAD3的靶基因的表达,两种转录因子调节的多个靶标列表中选择四个基因作为典型实例:增殖相关的CyclinB1,CDC25B和PLK1作为典型的FOXM1目标和与迁移相关的SLUG作为典型的SMAD3目标。结果发现M1-138抑制FOXM1和SMAD3的靶基因的表达。(7)运用裸鼠移植瘤实验证实M1-138抑制体内小鼠肿瘤的生长;通过qPCR和WB实验证实M1-138抑制肿瘤中FOXM1和SMAD3下游靶基因的表达;免疫组化实验证实增殖相关因子KI-67和PCNA表达下调。(8)通过小鼠实验,血细胞溶血试验和动物毒性试验检测M1-138对小鼠体重,血细胞溶血情况和动物毒性的影响,结果显示小鼠和血细胞对M1-138耐受良好。