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单细胞测序技术是近几年快速发展的一种新技术,虽然广泛应用于人类和动物遗传学,胚胎学和免疫学等学科的研究和疾病的诊断与治疗,但是植物单细胞测序研究仍然困难重重。本研究以玉米的花粉为模式材料,探索植物单细胞的分离和测序技术,建立相应的分析平台。在此基础上,通过两个实例研究探讨单细胞测序技术在植物领域的应用:1)通过对玉米四分体的四个小孢子的测序分析,首次在单细胞水平探讨了植物重组的遗传基础;2)通过对不同时期玉米单倍体诱导系的花粉进行测序分析,探讨了玉米单倍体诱导(Haploid induction,HI)发生的机制和规律。主要结果如下:1.发展一种分离植物单个四分体孢子的方法,用于基因组多重置换扩增(Multiple Displacement Amplification,MDA)。对来自24个F1四分体的96个小孢子的扩增DNA样品进行了全基因组重测序,平均深度为1.4X,平均基因组覆盖度为41%。通过测序,共获得599,154高密度的SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)标记,其相邻SNP物理间距的中位数为235bp。通过比较小孢子基因组的遗传背景,共鉴定到924个被精细定位的同源重组交换(Crossover,CO),发现玉米一次减数分裂平均发生38.5个CO。统计分析发现,CO更倾向于发生在靠近基因的区域,而且常常富集于基因的5’和3’末端。通过对5个CO区段进行Sanger测序,在每个区段中都发现了基因转换(Gene Conversion,GC),表明CO的产生常伴随着GC的发生。首次在小孢子中检测到了较强的交换负干涉和较弱的染色单体干涉。本研究在增强对减数分裂重组发生机制理解的同时,也为进一步提高育种效率提供了新思路。2.发展一种分离诱导系CAU5成熟花粉单核的方法。利用该方法,分离到来自22个CAU5花粉的66个单核。同时分离到来自18个CAU5四分体的72个小孢子。将CAU5的单核及单细胞样品进行基于PCR的全基因组扩增(Whole Genome Amplification,WGA)后,对其进行高通量测序和拷贝数变异(Copy Number Variation,CNV)分析。发现诱导系CAU5在三核花粉期存在高频的染色体非整倍性变异(6/22个花粉),而在四分体时期只存在很低频的倍性异常(1/72个小孢子),这说明诱导系的花粉在减数分裂期之后会产生染色体的片段化现象。3.发展一种分离常规自交系单精子的方法。利用该方法,分离到来自普通自交系B73的25个花粉的50个单精子和来自B73背景的诱导系(B73-inducer,80%的B73背景和20%的CAU2诱导系背景)的26个花粉的52个单精子,然后进行基于PCR的全基因组扩增,对其进行高通量测序和CNV分析。在B73-inducer的单精核中发现高频的染色体非整倍性(14/52精核)变异,频率远远高于自交系B73(3/50精核),说明单倍体诱导的发生可能和花粉精核的非整倍性变异相关。4.为了进一步证明花粉染色体片段化与单倍体胚诱导之间的关系,对来自与诱导系杂交授粉后9天的88个籽粒中的81个胚和81个胚乳DNA进行高通量测序分析。在7个胚中发现了父源基因组的全部消除。在1个胚中发现了大部分父源基因组的消除,但仍有少部分残余。在3个样品中检测到小片段的CNV。基于以上数据,得出结论:染色体的片段化是单倍体诱导的潜在原因之一,而且是一个持续发生的过程,当染色体已片段化的精核和卵细胞结合后,就可能发生父源染色体的消除,从而诱导产生单倍体。这个结果不仅支持单倍体诱导的双受精假说,同时也为解析单倍体诱导机制提供了新的视角和手段,在诱导系的培育和改良方面具有潜在的利用价值。