【摘 要】
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新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019,COVID-19）,由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（SARS-Co V-2）引起,它的迅速传播造成了全球健康危机,同时,变异株的出现给检测诊断及疫情防控带来了新挑战。为降低新型冠状病毒检测结果假阴性风险,减轻因靶区选择和引物设计造成的结果不准确现象,保证检测的特异性、灵敏度,本文进行新型冠状病毒双靶标荧光定量PCR检测,建立
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新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019,COVID-19）,由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（SARS-Co V-2）引起,它的迅速传播造成了全球健康危机,同时,变异株的出现给检测诊断及疫情防控带来了新挑战。为降低新型冠状病毒检测结果假阴性风险,减轻因靶区选择和引物设计造成的结果不准确现象,保证检测的特异性、灵敏度,本文进行新型冠状病毒双靶标荧光定量PCR检测,建立双靶标PCR体系并进行优化实验,对最终实验方案进行评价,评价内容包括灵敏度和线性范围,最低检测下限,拟合曲线性能优劣等。针对新型冠状病毒变异株的出现,本文建立了一种基于PARMS（penta-primer amplification refractory mutation system）技术的竞争性等位基因特异性PCR方法检测新型冠状病毒“关切变异株”（variant of concern,VOC）关键突变位点并实现快速分型。针对新型冠状病毒VOC中关键基因突变位点N501Y、E484K、L452R,K417N、K417T、P681H分别设计竞争性等位基因特异性引物和通用引物,利用等位基因特异性聚合酶链式反应和荧光能量共振转移原理,对新型冠状病毒DNA片段进行鉴别区分。结果显示所建立的双靶标荧光定量PCR检测方法中的N基因和ORF1ab基因扩增线性范围均可达到:1.3×10~6到13 copies/μL,N基因和ORF1ab基因R~2值分别为0.999和0.997,扩增效率分别为104.17%和106.54%,经概率回归分析,双靶标荧光q PCR检测体系的最低检测下限是5.793 copies/μL（95%置信区间:2.261-7.325 copies/μL）,所建立的检测方法灵敏度高,特异性强,检测性能良好。452、484、501位点的的最低检测下限分别是6.792 copies/μL（95%置信区间:4.93-8.605 copies/μL）,8.099 copies/μL（95%置信区间:6.074-10.321copies/μL）,7.434 copies/μL（95%置信区间:5.569-9.520 copies/μL）。417（AAG/AAT）、417（AAG/ACG）、681（CCC/CAC）位点的的最低检测下限分别是8.384 copies/μL（95%置信区间:6.747-10.674 copies/μL）,8.704 copies/μL（95%置信区间:6.966-11.117 copies/μL）,8.055 copies/μL（95%置信区间:6.504-10.125 copies/μL）。本研究所建立的双靶标荧光定量PCR方法和PARMS技术具有快捷、高效、低成本的特点,用于流行的新型冠状病毒VOCs检测鉴别,有助于新冠疫情的快速精准防控。
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