前言随着社会经济和交通运输的发展,骨折的发生率逐渐增加。骨骼是人体中的重要器官之一,它拥有着自己的发育过程、新陈代谢、修复和改建。随着骨折患者的增多,出现骨折不愈合的比例也逐渐增加,其主要由创伤、先天性畸形、恶性肿瘤、手术和感染等多种因素引起。影响骨折愈合的因素有很多,例如骨折部位、类型、血液供应以及患者的年龄和健康状况等,骨折对患者的生活和社会具有极大的不利影响。骨折不愈合的有限治疗方法以及其他骨重建技术所具有的局限性是我们增加对骨折愈合研究的两个重要因素。虽然骨骼具有相当大的修复能力,但在当再生条件不利的情况下,例如感染、周围组织血供不足、全身性疾病等时,就需要临床干预来促进骨再生。骨折的修复仍然是骨科临床的一大挑战。目前临床上采用的修复骨损伤的方法主要有自体骨移植,同种异体骨移植,异种骨移植和人工材料的植入等。这些治疗方法在临床应用上具有很大的局限性,包括不能与宿主周围组织融合,可用的供体组织有限,医源性损伤以及术后疼痛等。骨是一种动态且高度血管化的组织,其中血管和骨细胞之间存在紧密的空间和时间关系以确保骨骼完整性。骨折修复涉及多个事件的协调,例如成骨和血管生成。干细胞生物医学研究的最新进展表明,干细胞治疗在组织再生和器官修复方面具有重要的应用前景。干细胞是指能够高度增殖和具有自我更新能力且可以分化为多种细胞的原始细胞。其中成体干细胞能够跨胚层多系统分化。在胚胎形成过程中,中胚层分化为骨、软骨、肌肉、肌腱、髓基质、脂肪等多种间充质组织,而这些前体细胞因具有干细胞的特性而被称为间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)。间充质干细胞在骨折患者中具有缩短愈合时间和治疗骨不连的潜能,因为这些细胞不仅具有多样性,而且能够分化为成骨细胞,还具有免疫调节功能。因此,骨组织再生成功的关键是制备足够的MSCs。MSCs具有自我更新和多能性的主要特征,在再生医学中具有很大的应用潜力,它最初存在于许多出生后的组织中,例如骨髓、脂肪组织、皮肤、脐带和胎盘。从理论上讲,不同来源的MSCs都有可能分化为成骨和软骨细胞谱系。成骨对于骨质的稳态更新和骨折再生愈合也是必不可少的。塑造骨骼结构,确保骨骼的完整性,是一个贯穿一生的动态骨重塑过程,在这个过程当中涉及了多种细胞增殖、分化和细胞外基质的合成与钙化。骨重建依赖于骨吸收和骨形成的精确协调,在这个过程当中祖细胞、间充质干细胞分化成功能性成骨细胞,这些成骨细胞组织细胞外基质骨化形成新骨。基因检测已经发现了一些分子,它们在骨重塑过程中调控这些细胞的谱系,揭示了它们抵消骨骼损失和修复受损骨组织方面的潜力。没有血管系统就没有骨骼。血管生成在骨骼发育和骨折修复过程中起着至关重要的作用。与成骨相结合的血管生成主要发生在血管形成和介导营养物质、氧气、矿物质和代谢废物的运输中,这对于维持适当的骨基质合成和矿化至关重要。在血管生成过程中,内皮细胞被募集并增殖,参与毛细血管的形成。值得注意的是,新形成的血管需要MSCs稳定,MSCs与内皮细胞的相互作用通过分泌血管生成生长因子、细胞因子等信号分子进一步调控血管生成。基于近些年对于体内和体外的研究进展,我们利用骨形成和骨修复模型,为更好的了解血管系统在骨骼发育和骨折修复过程中的补充性质提供了依据。一个活跃的血管网络是组织工程骨存活和与现有宿主组织整合的必要前提。越来越多的证据表明,在各种激素,生长因子和机械应激的影响下,细胞因子通过引导细胞增殖、迁移和分化,促进受损骨组织周围的骨生长和愈合。转化生长因子-β 1(Transforming growth factor-β 1,TGF-β 1)是骨基质中含量丰富的细胞因子,可以被释放以诱导MSCs向成骨细胞迁移和分化以产生骨骼。而血小板衍生生长因子 BB(Platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB)也因其在血管生成中的作用而闻名,它被作为间充质来源细胞的一种强有力的促有丝分裂原,PDGF-βB被认为可以激活这些细胞,稳定新形成的血管,协调细胞成分,促进成骨细胞分化。PDGF-BB在血管周细胞-MSC-成骨细胞的多组分级联动力学中具有重要意义,表明PDGF-BB偶联TGF-β 1可以作为成骨因子之间的中心信号。本研究主要是探讨:(1)骨组织损伤后PDGF-BB与TGF-β 1表达变化及其功能;(2)PDGF-BB联合TGF-β 1在间充质干细胞迁移、增殖过程中的表达变化;(3)PDGF-BB联合TGF-β 1在间充质干细胞成骨过程中的表达变化;(4)PDGF-BB 与 MSCs 对血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达变化影响。通过研究PDGF-BB和TGF-β 1两者在联合作用对MSCs迁移、增殖与分化的影响,进一步探讨PDGF-BB联合TGF-β 1在骨折修复过程中所起到的作用。在本研究中,我们选取了6周龄小鼠骨髓,制作骨折模型,分离出骨髓间充质干细胞,通过PDGF-BB与TGF-β 1的干预,来检测这两个因子与骨髓间充质干细胞(MSCs)的迁移增殖和血管内皮细胞以及相关因子表达变化,从而研究PDGF-BB和TGF-β 1在骨修复中的机制。PDGF-BB联合TGF-β 1在骨折修复中的表达及其作用机制的研究目的:骨折的修复目前仍然是临床医生面临的一个巨大的挑战,如何有效的预防、治疗和康复是亟待解决的问题,而组织工程学提供了用于产生新骨的有希望的疗法。骨形成是一种细胞过程,对于整个生命中的骨骼发育非常重要,涉及骨生成与血管生成的耦合。在这里,我们研究了 PDGF-BB和TGF-β 1在骨折修复过程中的表达,并检测这两个因子与骨髓间充质干细胞(MSCs)的迁移、增殖和血管内皮细胞以及相关因子表达变化,为进一步研究二者在骨折修复机制的分子通路提供线索。有助于进一步认识骨折修复的分子机制以及相关因子的作用,为骨折的防治提供新思路。方法:1.通过在动物组织标本中,将第1周、3周、6周、9周时留取的骨折修复组织处理后,应用实时定量PCR技术、Western Blot检测PDGF-BB、TGF-β 1及VEGF的mRNA表达及蛋白表达量,采用Pearson检验对三者进行相关性分析;通过建立种植体移植物模型,在第2周、4周、6周、8周、10周时留取骨组织及种植物标本,测定种植物作用时间,通过AP及Von Kossa染色法检测骨组织中的碱性磷酸酶含量及钙盐含量。2.通过体外培养MSCs细胞及EPCs细胞,应用Transwell实验检测不同条件下,MSCs细胞的迁移能力及增殖;采用ARS染色观察对不同条件下的MSCs细胞的钙质含量;通过实时定量PCR技术检测成骨相关蛋白Runx2、Alkaline phosphase(AP)、Collagen type I alpha 1(Coll α 1)及 Osteocalcin(Ocn)的基因表达水平变化;使用流式细胞技术来检测内皮祖细胞表面标志物;运用ELISA检测不同处理条件下的EPCs细胞上清液中VEGF的表达量,并从分子水平上探讨骨折修复反应发生的机制。结果:1.与正常小鼠骨组织相比,小鼠骨折修复中的PDGF-BB、TGF-β 1及VEGF的mRNA表达及蛋白表达量高于对照组;而在基因表达水平上TGF-β 1分别与PDGF-BB、VEGF呈正相关;通过测定种植体移植物,发现其作用时间大于4周,且碱性磷酸酶含量及钙盐含量高于对照组。2.通过Transwell实验分别发现PDGF-BB、TGF-β 1可显著促进MSCs迁移及增殖,而且我们还发现TGF-β 1比PDGF-BB显示出更大的潜力;ARS染色观察到PDGF-BB处理后的MSCs细胞细胞内钙质丰富,而TGF-β 1处理后的MSCs细胞细胞内钙质减少;通过检测成骨相关蛋白我们发现其在PDGF-BB组表达升高,而在TGF-β 1表达减少,当二者共同作用时,相关蛋白基因表达含量Runx2、AP、Coll a 1表达增加,而Ocn表达减低;PDGF-BB能够诱导EPCs毛细管形成,加入MSCs后,进一步增强EPCs管形成;通过ELISA检测到VEGF在经PDGF-BB和MSCs处理的EPCs中高表达。结论:1.PDGF-BB和TGF-β 1都能够招募MSCs并促进其迁移、增殖,但TGF-β1更为显著;相反,PDGF-BB促进成骨作用,但TGF-β 1抑制成骨作用。2.PDGF-BB和TGF-β1的联合应用可显着诱导体内新骨形成。3.PDGF-BB与MSCs共培养可增强诱导EPCs的血管生成。4.PDGF-BB和TGF-β 1联合应用在骨折愈合修复中起到了重要作用,因此,适当调控MSCs中二者的表达量可能是调节骨折损伤后修复的一条新途径,也成为研究促进骨折后骨修复的一个新靶点。