论文部分内容阅读
精子发生是一个连续而又复杂的高度协调的细胞增殖、分化的动态过程,主要包括精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂和精子细胞的变形等三个阶段。每个阶段都受到基因表达的精确调控,才能确保精原细胞分化为精母细胞,最终形成单倍体长形精子。目前,精子发生的生物学机制仍未完全揭示,探讨与精子发生相关的基因、分子及其作用机制,依然是未来生殖生物学研究的热点和重点。不均一性核糖核蛋白K（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K,hnRNPK）是一个多功能蛋白,也是重要的转录调控因子,对动物胚胎发育及细胞的增殖分化起着关键的调控作用。已有研究表明hnRNPK高表达于动物睾丸组织中,在精子发生过程中可能起着重要作用,但缺乏系统的研究。本研究通过构建雄性生殖细胞特异性敲除小鼠模型,研究hnRNPK在小鼠精子发生过程中的作用及分子机制。主要取得了以下研究结果:（1）qRT-PCR和Western blot方法证实hnRNPK在小鼠睾丸组织中高表达;免疫组织荧光结果表明hnRNPK在精原细胞、粗线期精母细胞和圆形精子细胞中具有较高的表达水平。（2）利用Cre-Loxp系统,选取Stra8-Cre+/-小鼠与hnRNPKflox/flox小鼠杂交,得到hnRNPKflox/-/Stra8-Cre+/-的杂合子小鼠,再用杂合子雌性小鼠与雄性hnRNPKflox/flox小鼠交配得到hnRNPK基因敲除小鼠(hnRNPKflox/flox/Stra8-Cre+/-,简称KO);Western blot和免疫荧光表明hnRNPK在小鼠睾丸组织生殖细胞中特异性敲除,该模型可用于后续进一步研究。（3）KO小鼠出生率符合孟德尔遗传定律,生长发育正常,外观与野生型相比无显著差异,但睾丸体积变小,从14日龄起睾丸重与体重比值显著小于野生型小鼠（p<0.05）;睾丸组织HE染色结果发现从14日龄起KO小鼠睾丸曲细精管管腔直径显著小于野生型（p<0.05）,并且大部分区域出现空泡状、生殖细胞层缺失,管腔细胞数目减少;附睾组织HE染色结果显示KO小鼠附睾管腔中大多呈现空腔,无成簇精子发生;生育力测试试验表明KO小鼠雄性不育。以上结果表明减数分裂前生殖细胞中特异性敲除hnRNPK影响了精子发生的正常进行,进而影响小鼠睾丸发育。（4）利用免疫荧光技术结合计数统计分析以确定缺失的细胞类型,结果显示:与野生型相比,KO小鼠中γH2AX阳性细胞数目显著减少,特别是γH2AX点状着色的粗线期或双线期精母细胞（p<0.05）,而PLZF和SOX9阳性着色的细胞数目无显著差异（p>0.05）;Ki67阳性着色细胞数目也显著减少（p<0.05）,且减少的多为减数分裂期细胞;进一步通过TUNEL检测细胞凋亡,发现敲除小鼠中凋亡细胞数目多于野生型（p<0.05）。以上结果表明hnRNPK敲除抑制生殖细胞增殖促进凋亡,进而导致管腔中减数分裂期细胞显著减少,提示hn RNPK敲除可能通过影响精母细胞减数分裂过程进而阻滞精子发生。（5）通过免疫组织荧光检测DNA损伤相关蛋白γH2AX和hnRNPK,顶体标志蛋白PNA和hnRNPK的表达,发现在KO小鼠中能观察到hnRNPK阴性的粗线期精母细胞,但不能观察到hnRNPK阴性的双线期精母细胞和hnRNPK阴性的圆形精子;进一步通过染色体铺展结合免疫组织荧光检测联会复合体蛋白SYCP3和hnRNPK的表达,发现KO小鼠中可以观察到粗线期精母细胞,而双线期精母细胞数量很少。以上结果表明hnRNPK敲除后可能通过影响粗线期精母细胞向双线期精母细胞的转变过程进而导致精子发生减数分裂进程阻滞,无法形成圆形精子。（6）对4周龄KO和WT小鼠睾丸组织进行RNA-Seq分析,通过q RT-PCR进一步验证差异表达基因的表达模式与RNA-seq结果相符。结果发现,与野生型相比,4W上调基因6227个,下调基因3841个（q<0.05,fold change≥1.5）。进一步对差异表达基因分别进行GO功能聚类分析发现:上调表达基因主要集中在凋亡过程和负调控细胞增殖过程,下调表达基因主要集中在精子发生和精子活力过程,揭示hnRNPK与精子发生密切相关。在KO小鼠睾丸的下调基因中,基因表达量较高且下调倍数较大的基因类群主要与精子发育、睾丸特异组蛋白变体以及圆形精子形成相关基因。KEGG富集分析显示上调表达基因富集的通路有PI3K-Akt信号通路和ECM相互作用通路,下调表达基因富集的通路有c AMP信号通路,这暗示hnRNPK可能通过参与这些信号通路从而调控精子发生过程。综上所述,本研究通过Cre-LoxP系统首次成功构建了减数分裂前生殖细胞特异性敲除hnRNPK小鼠,并从细胞、组织和个体水平系统研究了hnRNPK敲除对小鼠精子发生过程的影响。发现hnRNPK敲除会导致减数分裂期细胞增殖减少、凋亡增多,精子发生在稍早于圆形精子阶段发生阻滞,不能形成圆形精子,导致雄鼠不育;KO小鼠曲细精管管腔中可以观察到hnRNPK阴性的粗线期精母细胞,但无hnRNPK阴性的双线期精母细胞,表明减数分裂前期阶段出现一定缺陷;转录组测序发现hnRNPK在精子发生中主要通过参与PI3K-Akt信号通路影响精子发育、睾丸特异组蛋白变体以及圆形精子形成相关基因的表达。这些研究结果表明hnRNPK作为一个关键的转录因子,可能参与调控减数分裂粗线期到减数分裂后基因表达,从而影响精子发育。