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肾脏毛细血管的稀疏既是慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)导致的结果,又是促进CKD向肾间质纤维化进展的关键环节,了解毛细血管稀疏的触发机制,对探讨改善血管稀疏现象而减轻肾间质纤维化的发生发展的治疗策略具有重要的指导意义。内皮祖细胞(putative endothelial progenitor cells,pEPCs)是由一群具有分化成内皮细胞潜能的干细胞组成,机体组织缺血时,可以分泌干细胞衍生因子(stem cell derived factor-1,SDF-1)等,促进pEPCs从骨髓动员,参与损伤血管的修复,改善组织缺血,减轻组织损伤。但关于pEPCs作用于缺血脏器改善血管损伤的具体机制却不大统一,有的研究表明pEPCs通过直接分化成内皮细胞参与血管生成,有的研究又表明pEPCs通过旁分泌作用调控远距离靶向受体细胞,通过促进血管生长因子等的分泌参与血管的生成。本实验旨在研究pEPCs在肾脏缺血再灌注(ischemia reperfusion,IR)构建的肾间质纤维化模型中的作用及具体机制。实验选择从小鼠骨髓提取并培养得到的pEPCs以及pEPCs上清(pEPCs-cultured medium,pEPCs-CM)分别输注到IR小鼠体内,观察其对肾脏血管内皮细胞、周细胞和肾间质纤维化的影响。同时采用血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB),探讨pEPCs、周细胞与肾脏纤维化三者的关系。实验结果发现pEPCs上清具有pEPCs等同的肾脏保护作用,都可以改善肾脏毛细血管稀疏现象,减轻肾损伤和间质纤维化。且pEPCs可以调控PDGFR-β的表达,抑制PDGF-BB加剧的肾损伤和纤维化。因此pEPCs可以通过旁分泌作用调控PDGFR-β阳性的周细胞,抑制肾损伤和间质纤维化。第一部分内皮祖细胞通过改善毛细血管稀疏,减轻缺血再灌注诱导的肾小管损伤和间质纤维化目的:本研究主要探讨了内皮祖细胞在缺血再灌注诱导的肾脏损伤和慢性肾间质纤维化中的作用以及可能机制。方法:实验选取C57BL/6雄性小鼠共20只,分为4组,每组5只:正常组(N)、正常加内皮祖细胞组(N+p EPCs)、造模组(IR)和造模加内皮祖细胞组(IR+p EPCs)。小鼠行假手术或被实施左侧肾脏缺血再灌注手术,采用血管夹夹住肾血管,30分钟后恢复血流,观察肾脏血流在几秒钟内恢复即为缺血再灌注成功。手术后6小时给予小鼠经尾静脉注射内皮祖细胞(2×105个p EPCs/只小鼠)或者相等剂量的细胞悬浮液(磷酸盐缓冲液)注射,于术后第5天、10天和30天收取组织标本。通过基础病理染色、荧光染色、western blot和q RT-PCR技术评估肾脏损伤以及纤维化程度;采取荧光染色检测肾脏管周毛细血管的数目和分布、内皮细胞的增殖能力及与周细胞的结构定位。结果:内皮祖细胞输注促进血管内皮细胞的增殖,维持了血管结构的稳定,从而改善了肾脏缺血再灌注诱导的血管稀疏现象,减轻了肾小管损伤和肾间质纤维化。结论:内皮祖细胞通过调控血管内皮细胞的增殖,促进血管的生成和维持了血管结构稳定,减轻肾小管损伤和肾间质纤维化。第二部分内皮祖细胞通过旁分泌作用改善肾血管稀疏现象,减轻肾损伤和肾脏纤维化目的:本研究主要探讨了内皮祖细胞参与肾脏保护作用的具体机制。方法:1.选取GFP小鼠提取内皮祖细胞,输注入IR造模小鼠体内,于手术后24小时和48小时追踪内皮祖细胞在小鼠肾脏中的数量和位置。2.实验选取C57BL/6雄性小鼠共15只,分为3组,每组5只:正常加给内皮祖细胞上清组(N+p EPCs-CM)、造模组加给基础培养基组(IR+EBM-2)和造模加给内皮祖细胞上清组(IR+p EPCs-CM)。小鼠行假手术或被实施左侧IR手术。术后6小时、24小时和48小时给予内皮祖细胞上清(一共2×105个内皮祖细胞收集的上清,分三次等量尾静脉注射)或者相等剂量的内皮祖细胞基础培养基EBM-2注射,于术后5天收取组织标本。3.选取雄性C57BL/6小鼠,行双侧缺血再灌注损伤,分为N组,IR组,IR+p EPCs组和IR+p EPCs-CM组,术后5天收取标本。4.体外培养人脐静脉内皮细胞,采用过氧化氢构建内皮细胞缺氧模型,观察内皮祖细胞上清对脐静脉内皮细胞的作用。通过组织染色、以及从蛋白水平和RNA水平评估肾脏损伤以及纤维化;荧光染色追踪内皮祖细胞以及检测间质血管;体外在蛋白和RNA水平检测内皮细胞凋亡,采取荧光和3D基质胶检测体外内皮细胞血管形成,检测RNA水平血管形成相关因子的表达。结果:体内实验发现输注的内皮祖细胞仅有少量几颗存留在损伤的肾脏间质并参与血管的形成,而内皮祖细胞上清也可以改善肾脏缺血再灌注诱导的血管稀疏,减轻周细胞的增殖和向肌成纤维细胞转分化,减轻肾脏纤维化。p EPCs和p EPCs-CM改善IR导致的肾功能损伤具有同样的效果。体外内皮祖细胞上清与脐静脉内皮细胞共培养增加了内皮细胞的抗凋亡能力,促进血管形成因子的分泌,提高了内皮细胞的血管形成能力。结论:内皮祖细胞通过旁分泌作用调控血管内皮细胞,改善缺血再灌注诱导的血管稀疏,减轻肾损伤和肾脏纤维化。第三部分内皮祖细胞通过调控PDGFR-β阳性的周细胞改善肾脏纤维化目的:本部分研究主要探讨了内皮祖细胞通过调控周细胞抑制肾脏纤维化的具体机制。方法:体内实验中选取C57BL/6雄性小鼠共15只,分为3组,每组5只:正常加给内皮祖细胞上清组(N+p EPCs-CM)、造模加给基础培养基组(IR+EBM-2)和造模加给内皮祖细胞上清组(IR+p EPCs-CM)。小鼠行假手术或被实施左侧IR手术。术后6小时、24小时和48小时给予内皮祖细胞上清(一共2×105个内皮祖细胞收集的上清,分三次等量尾静脉注射)或者相等剂量的内皮祖细胞基础培养基EBM-2注射,于术后5天收取组织标本。体外实验采取内皮祖细胞上清与周细胞共培养,采取TGF-β和PDGF-BB刺激周细胞,构建周细胞-肌成纤维细胞转分化模型。实验探讨了p EPCs在周细胞增殖和转分化中的作用,观察内皮祖细胞通过调控PDGFR-β阳性的周细胞对肾损伤和纤维化的影响。采取Western blot检测周细胞、肌成纤维细胞与刺激因子的关系。结果:体内实验中发现IR激活了肾脏PDGFR-β通路,刺激了周细胞的增殖和转分化,增加了肾脏纤维化的来源。p EPCs-CM抑制了PDGFR-β通路,从而抑制周细胞及向肌成纤维细胞转分化,从来源上减轻了肾脏纤维化。体外实验中发现PDGF-BB参与促进了周细胞的增殖和转分化,阻断PDGF-BB可以抑制周细胞的生长,而p EPCs-CM减轻了PDGF-BB对周细胞的增殖和转分化作用。采取TGF-β刺激周细胞,可以观察到周细胞表达肌成纤维细胞标志物α-SMA增加。PDGF-BB具有协助作用促进TGF-β诱导的α-SMA的表达。p EPCs-CM减轻了TGF-β诱导的α-SMA表达增加。结论:p EPCs-CM通过调控PDGFR-β通路抑制周细胞的增殖和转分化从而改善肾脏纤维化。