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【目的】糖尿病是引起老年人认知功能下降的高危因素,本文旨在探讨糖代谢产物甲基乙二醛(Methylglyoxal,MG)侧脑室注射给药对C57BL/6J小鼠认知功能及脑组织tau蛋白磷酸化程度的影响;观察新型降糖药GLP-1类似物Liraglutide对MG诱导的小鼠认知功能损伤的改善作用,初步探讨其可能的作用机制。在体外部分,通过观察Liraglutide对MG诱导的人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)损伤的改善作用,结合相关通路的抑制剂,进一步验证Liraglutide调节MG诱导的神经细胞tau蛋白磷酸化的作用及其机制。【方法】第一部分:1.探讨侧脑室注射MG对小鼠认知功能的影响。SPF级8周龄C57BL/6J雄性小鼠随机分为溶媒对照生理盐水(Normal saline,NS)组、MG低剂量组、MG中剂量组、MG高剂量组、阳性对照β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)组,各亚组10只,分别单次侧脑室注射等体积0.35μmol MG、0.7μmol MG、1.4μmol MG或410pmol寡聚体Aβ1-42诱导认知功能障碍,对照组侧脑室注射等体积生理盐水。8周后应用Morris水迷宫观察不同剂量的MG对小鼠认知能力损伤情况,同时Western-blot检测tau蛋白磷酸化程度及其对相关的调控信号通路Akt/GSK-3β的影响。2.探讨皮下注射Liraglutide对MG侧脑室注射诱导小鼠认知功能损伤的改善作用,并对机制做初步探讨。SPF级8周龄C57BL/6J雄性小鼠随机分为溶媒对照Control组、Liraglutide组、MG组、MG+Liraglutide组、模型阳性对照Aβ组及Aβ+Liraglutide组,每个亚组13-15只。MG组、MG+Liraglutide组采用侧脑室注射0.7μmol MG,Aβ组及Aβ+Liraglutide组采用侧脑室注射410 pmol寡聚体Aβ1-42。应用Y迷宫、Morris水迷宫等行为学方法观察皮下注射Liraglutide(25nmol/kg/day)8周对小鼠学习和记忆的改善情况,利用透射电镜观察小鼠海马CA1区锥体细胞及突触的超微结构,通过检测小鼠大脑皮层超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidas,GSH-PX)活力及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量观察小鼠脑组织氧化应激情况,免疫组织化学检测小鼠脑组织皮层p-tau(Ser396)的表达,Westernblot检测海马p-tau(Ser202)及p-tau(Ser396)的表达及调控通路Akt/GSK-3β的活化程度。第二部分:结合PI3K/Akt/GSK-3β信号通路中PI3K的抑制剂Wortmannin,观察Liragltuide对MG诱导SH-SY5Y神经细胞tau蛋白的过度磷酸化的影响及其可能的机制。该部分予以不同浓度的Liraglutide(0,10,100,200 nM)预处理SH-SY5Y神经细胞24小时,之后用不同浓度的MG(0,250,500,750μmol/L)诱导细胞12h,通过CCK8实验检测细胞的存活率及凋亡率选取合适的作用浓度。实验分为溶媒对照组、Liraglutide组、MG组、MG+Liraglutide组、MG+Liraglutide+Wortmannin组和MG+GLP-1组。Western-blot检测不同组的p-tau(Ser202)及p-tau(Ser396)表达水平,对调节tau蛋白信号通路的关键信号分子Akt、GSK-3β磷酸化水平分别进行检测。进一步应用PI3K抑制剂Wortmannin进行干预,以确认Liraglutide是否通过Akt/GSK-3β信号通路影响tau蛋白的磷酸化水平。【结果】1.不同剂量的MG侧脑室注射后能损伤小鼠的认知功能,但各剂量间无显著差别,因此在后续的实验中选择侧脑室注射中等剂量的MG(0.7μmol)侧脑室注射以诱导认知功能损伤模型;而侧脑室注射0.7μmol的MG可能可以通过Akt/GSK-3β信号通路促进小鼠脑组织tau蛋白的磷酸化;2.行为学实验提示:持续皮下注射Liraglutide(25nmol/kg/day)8周对MG侧脑室注射诱导的小鼠认知功能损伤可能具有改善作用。并且,透射电镜提示Liraglutide能够减少MG诱导的认知功能损伤小鼠海马CA1区锥体细胞及突触的结构退化。3.皮下注射Liragltide具有改善氧化应激的作用,能够降低MG诱导的认知功能损伤小鼠脑组织中的丙二醛(MDA)的含量,可以提高超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性,从而减少神经元细胞内脂褐素累积和线粒体结构的损伤,可能具有提高机体抗氧化能力并延缓神经细胞退行性改变。并且,可能通过调节海马区Akt/GSK-3β信号通路,降低p-tau(Ser202)及p-tau(Ser396)的表达。对Aβ组进行干预,也得到类似的结果。4.体外实验表明:Liraglutide预处理SH-SY5Y神经细胞能明显提高MG对其损伤的存活率。Western-blot结果显示,Liraglutide能降低MG诱导的神经细胞中p-tau(Ser202)及p-tau(Ser396)的表达。在给予PI3K抑制剂Wortmannin之后,Akt和GSK-3β磷酸化程度明显降低,而p-tau(Ser202)及p-tau(Ser396)的表达明显升高。提示Liraglutide可能通过调节Akt/GSK-3β信号通路影响tau蛋白的过度磷酸化水平。【结论】MG可能通过Akt/GSK-3β信号通路诱导tau蛋白磷酸化从而损害认知功能;Liraglutide干预后能通过改善抗氧化应激,减少神经元细胞的氧化损伤,调节Akt/GSK-3β信号通路降低磷酸化tau蛋白的表达,从而改善认知功能。此外,Liraglutide对阳性对照药Aβ引起的小鼠认知功能损伤也具有改善作用。因此,GLP-1类似物Liraglutide可能具有改善认知功能,促进神经退行性病变的恢复的作用。