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第一部分肾透明细胞癌miRNA表达谱的检测及miR-200c与肾癌临床病理参数之间的相关性分析目的：研究肾透明细胞癌与癌旁正常组织miRNA表达谱的差异,分析(?)miR-200c与肾透明细胞癌临床病理参数的相关性,为肾透明细胞癌的诊断和鉴定诊断提供有用的参考指标,为治疗效果评估和预后预测提供依据。方法：我们利用包含了851个人类成熟(?)niRNAs探针的生物芯片来检测5对肾透明细胞癌组织与癌旁正常组织中miRNAs的表达,并利用统计学分析方法分析癌组织与癌旁组织miRNAs的表达差异,按筛选条件fold change>2, P<0.05列为表达差异显著。然后利用实时定量PCR法进一步验证25对肾透明细胞癌组织与癌旁正常组织中miR-200c的表达变化,并利用统计学分析方法分析其与病理参数之间的关系。结果：microarray芯片共发现118个miRNAs在肾透明细胞癌与癌旁正常组织中存在表达差异,其中74个miRNAs表达具有显著差异。74个miRNAs中有30个miRNAs在肾透明细胞癌组织中表达明显上调,另外44个miRNAs表达明显下调。在另外的25对组织中,实时定量PCR显示相对于癌旁正常组织,miR-200c在肾透明细胞癌组织中的表达下降明显,符合(?)nicroarray芯片的结果,但miR-200c的表达变化与肾透明细胞癌病理参数间未见明显相关性。结论：肾透明细胞癌与癌旁正常组织的miRNAs表达谱具有明显差异,可以为肾透明细胞癌的诊断和与其他肿瘤的鉴别诊断提供有用的参考指标。miR-200c在癌组织中表达明显下调,有可能扮演抑癌基因的角色。第二部分miR-200c抑制肾癌细胞增殖的机制研究目的：我们的microarray芯片结果显示肾透明细胞癌组织中(?)miR-200c的表达量明显低于癌旁正常组织,有作为抑癌基因的潜能。深入研究miR-200c在肾癌细胞增殖中的作用及相关机制探讨,为未来肾癌靶向治疗的开发提供理论基础。方法：首先利用实时定量PCR检测三株肾癌细胞中miR-200c的表达量,筛选合适的细胞株,利用包装了hsa-miR-200c的慢病毒感染细胞建立稳定过表达miR-200c的肾癌细胞株模型；然后利用这个细胞模型探索miR-200c对肾癌细胞增殖的影响,MTT法测定细胞增殖曲线,PI染色和流式细胞仪分析细胞周期；再通过生物信息学方法预测与细胞增殖相关的目标靶基因,利用实时定量PCR、Westernblot和荧光素酶报告基因法进行靶基因的验证；最后动物体内实验进一步证实(?)miR-200c对肾癌细胞增殖的影响。结果：在SN12-PM6、786-0和A-498细胞中,miR-200c的表达量明显低于25个癌旁正常组织的平均表达量。我们利用慢病毒感染SN12-PM6和786-0建立的肾癌细胞模型是成功的,绿色荧光达90%以上,能稳定过表达miR-200c。MTT法测定细胞增殖曲线发现(?)miR-200c可以抑制肾癌细胞的生长,以72小时最明显。PI法染色后流式细胞仪检测发现miR-200c可以使肾癌细胞停滞在G0/G1期,而拮抗miR-200c的表达后,细胞增殖抑制作用能被逆转。Westernblot法证明(?)miR-200c组CDK2的表达量明显低于miR-Ctr组,荧光素酶报告基因法证明CDK23’UTR区存在(?)miR-200c的结合位点。最后动物实验证明miR-200c组肾癌原位移植瘤的肿瘤重量要明显小于miR-Ctr组。结论：miR-200c能在转录后水平调控CDK2的表达,使肾癌细胞停滞在G0/G1期,从而抑制肾癌细胞的增殖。这为未来肾透明细胞癌靶向治疗的开发研究提供理论基础第三部分miR-200c调节上皮间质转化参与肾癌细胞侵袭迁移的初步研究目的：本部分拟研究miR-200c能否调节上皮间质转化过程,起到抑制肾癌细胞侵袭转移的作用,这将有助于深入了解肾癌的转移过程,并可以鉴定到有意义的治疗靶标。方法：利用第二部分中建立的稳定过表达miR-200c的肾癌细胞株模型,应用(?)answell法检测过表达miR-200c的肾癌细胞侵袭转移能力的改变。实时定量PCR法检测SN12-PM6、786-0细胞和25对肾透明细胞癌组织与癌旁正常组织样本中ZEB1和E-cadherin的表达,分析肾癌细胞和肾癌组织中miR-200c、ZEB1和E-cadherin三者的关系。最后运用实时定量PCR和Westernblot法检测过表达miR-200c后肾癌细胞ZEB1、E-cadherin在mRNA和蛋白水平上表达的变化。结果：过表达miR-200c后,相比miR-Ctr组,miR-200c组肾癌细胞的侵袭和迁移能力明显下降。在肾癌细胞和肾癌组织中,miR-200c的表达量与ZEB1成负相关,与E-cadherin成正相关。实时定量PCR法结果显示miR-200c组ZEB1mRNA的表达量要明显低于miR-Ctr组,E-cadherin mRNA的表达量则明显上升。在蛋白水平上,westernblot结果显示miR-200c组ZEB1的表达明显下降,E-cadherin的表达则明显上升。结论：miR-200c可直接靶向作用于ZEB1,降低ZEB1的表达间接使E-cadherin的表达升高,调节上皮间质转化从而抑制肾癌细胞的侵袭和转移。