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第一部分杨梅黄酮对人膀胱癌T24细胞增殖的影响目的研究杨梅黄酮(Myricetin)在体外对人膀胱癌细胞系T24细胞增殖和细胞周期的影响以及其可能的机制。方法用MTT法观察不同浓度的杨梅素(0,10,20,40,60,80,100μM)作用不同时间(12,24,36,和48 h)后对T24细胞增殖的影响。收集不同浓度Myricetin(0,20,40,80μM)作用24 h的T24细胞,碘化丙锭(PI)染色后经流式细胞仪检测,并对获取数据进行细胞周期分析。应用Western blotting方法检测参与调节细胞周期的相关蛋白Cyclin B1和CDC2的表达,以探讨相关作用机制。结果1.Myricetin能显著抑制T24细胞增殖,并随药物浓度升高(10-80μM)和作用时间的延长(12-48 h)而抑制作用增强,呈明显剂量和时间依赖性。2.经流式细胞仪检测,不同浓度Myricetin(0,20,40,80μM)作用24 h使T24细胞在G2/M期细胞显著增多,出现G2/M期阻滞,呈剂量依赖性。3.Myricetin(0,20,40,80μM)作用48h后,随着作用浓度的增加,T24细胞CyclinB1和cdc2的表达逐渐降低,呈剂量依赖性。结论Myricetin能显著抑制T24细胞的增殖,其抑制作用呈时间和剂量依赖性。Myricetin可抑制T24细胞中Cyclin B1和CDC2的表达,其可能是诱导T24细胞G2/M期阻滞的分子机制之一。第二部分杨梅黄酮对人膀胱癌T24细胞凋亡的影响目的研究Myricetin在体外对人膀胱癌细胞系T24细胞凋亡的诱导作用,并探讨其诱导凋亡的可能的分子机制。方法研究Myricetin对T24细胞增殖的抑制作用是否为诱导细胞凋亡的结果。用光学显微镜及荧光染色观察Myricetin作用后的T24细胞的凋亡形态学改变。采用流式细胞仪(PI和annexin V双染法)检测细胞凋亡率的变化。采用Western blotting方法检测不同浓度Myricetin(0,20,40,80μM)作用24h和48h后T24细胞中caspase-3,PARP,Bcl-2家族等相关凋亡蛋白表达的变化。结果1.不同浓度Myricetin(0,20,40,80μM)作用于T24细胞24 h后能明显诱导细胞凋亡,凋亡的诱导作用呈剂量依赖性。2.光学显微镜下观察显示不同浓度Myricetin(0,20,40,80μM)作用于T24细胞24h后使细胞密度呈剂量依赖性降低。同时观察到凋亡细胞所具有的典型形态学改变。3.通过流式细胞仪(PI和annexin V双染法)检测发现Myricetin作用于T24细胞24 h后细胞凋亡呈剂量依赖性增加。4.Myricetin(0,20,40,80μM)作用24 h后,T24细胞中caspase-3和PARP均未被激活。5.Myricetin(0,20,40,80μM)作用48 h后,随着作用浓度的增加,T24细胞中Bax表达逐渐增高,Bcl-2的表达逐渐降低,呈剂量依赖性。结论Myricetin能诱导T24细胞凋亡,凋亡的诱导作用呈显著的剂量依赖性。Myricetin能调节T24细胞中Bcl-2家族蛋白的表达,其可能是诱导T24细胞凋亡的分子机制之一。第三部分杨梅黄酮对人膀胱癌T24细胞侵袭转移的影响目的研究Myricetin在体外对人膀胱癌细胞系T24细胞侵袭转移能力的影响及其可能机制。方法划痕愈合实验检测Myricetin对T24细胞迁移能力的影响,Transwell小室进行人工重组基底膜侵袭实验检测Myricetin对T24细胞侵袭能力的影响。采用RT-PCR方法检测Myricetin(0,20,40,80μM)作用24h后的T24细胞中MMP-9mRNA和MMP-2 mRNA的表达。结果1.Myricetin(0,20,40,80μM)作用不同时间(0,6,12和24h)后,T24细胞的迁移能力逐渐降低,呈剂量和时间依赖性。2.体外的侵袭实验显示Myricetin(0,20,40μM)作用24 h后,T24细胞侵袭能力显著降低。3.Myricetin(0,20,40,80μM)作用24 h后,随着作用浓度的增加,T24细胞的MMP-9 mRNA表达降低。结论Myricetin能显著抑制T24细胞的迁移,侵袭能力。Myricetin这种侵袭转移抑制能力可能与降低MMP-9的表达有关。第四部分杨梅黄酮对人膀胱癌T24细胞体内实验的研究目的研究Myricetin对人膀胱癌T24裸鼠移植瘤的体内抑瘤活性。方法将12只裸鼠随机分成2组:空白对照组,Myricetin处理组;于右后腿背侧皮下接种T24细胞5×10~5/只。对照组裸鼠在接种后的14～22d,每隔一天于肿瘤部位皮下注射PBS,每只裸鼠注射量为150μl。Myricetin组裸鼠在接种后的14～22d,每隔一天于肿瘤部位注射相应Myricetin,剂量为100μg/只。从第4周起,每隔一天测量各组肿瘤的直径及各组裸鼠的体重。结果1.Myricetin可抑制人膀胱癌T24裸小鼠移植瘤的生长。2.Myricetin可延长人膀胱癌T24裸小鼠的生存期。结论Myricetin可抑制人膀胱癌T24细胞系裸鼠移植瘤的生长。