嗜热毛壳菌β-葡萄糖苷酶的分离纯化、性质研究及基因克隆

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β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)(β-D-葡糖苷葡萄糖水解酶;EC3.2.1.21),属于水解酶类,别名纤维二糖酶(cellobiase),龙胆二糖酶(gentobiase),苦杏仁苷酶(amygdalase)。β-葡萄糖苷酶广泛存在于植物、哺乳动物以及微生物中。由于其重要的生物学功能和广阔的应用前景,β-葡萄糖苷酶已成为近几年来人们研究的热点。 嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum是一种分布广泛的腐生真菌,它的生境多以植物秸秆、畜禽排泄物等的堆积发酵为主,能够在45℃~50℃的高温下很好的繁殖生长。而绝大多数的真核生物若长期暴露于40℃以上将无法存活。在嗜热菌领域,对β-葡萄糖苷酶的研究还不多。楚春雪等曾从嗜热毛壳菌中分离纯化出一种β-葡萄糖苷酶,分子量约为80kDa。 本论文第一部分对嗜热毛壳菌C.thermophilum产生的另外一种β-葡萄糖苷酶进行了分离纯化及性质研究。粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析、Sephacryl S-100分子筛层析等步骤后获得凝胶电泳均一的β-葡萄糖苷酶。经10%SDS-PAGE和凝胶过滤层析方法分别测得该酶的分子量大小约为118kDa和120kDa。该酶反应的最适温度为70℃,最适pH值为4.0~5.0。有高的热稳定性,在60℃保温1小时酶活性不丧失,在70℃时的半衰期为16min,在90℃保温10min仍具有7.6%的活性。且能在pH4.0~11.0之间保持稳定。金属离子对β-葡萄糖苷酶的活性影响较大,其中Ca2+、Ba2+对酶有激活作用,而Zn2+、Cu2+、Al3+、Ag+、Hg2+对酶有显著的抑制作用。 本论文第二部分根据八种真菌β-葡萄糖苷酶的同源保守序列设计了两条简并引物,通过RT-PCR及快速扩增cDNA3’末端(3’-RACE)的方法,克隆了嗜热毛壳菌β-葡萄糖苷酶的编码基因片段bgl,cDNA长度为1872bp,包含1770bp(1~1770bp)的编码区,编码589个氨基酸,下游有终止密码子TGA和polyA。
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