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青光眼为全球的第二大致盲眼病,也是第一位的不可逆性致盲性眼病。青光眼视神经损害的确切机制尚未完全明了,目前认为眼压升高所致视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)轴浆流受阻和机械压迫等因素导致的RGCs凋亡是其发病的重要病理改变。在青光眼视神经保护研究方面,以往主要集中在神经营养因子,一氧化氮(NO)合成代谢和自由基清除等方面。而关于青光眼视网膜微环境的研究,特别是视网膜微环境中的离子及离子通道的研究却很少。近年来,由于Müller细胞等神经胶质细胞在视网膜内特有的结构和功能以及它们对正常及病理状态下视网膜微环境的调控的重要作用而越来越受到重视。腺苷是中枢神经系统一种重要的神经调质,在生理状态下,细胞内外的腺苷浓度很低,常低于1~2μmol/L,在一些应激情况下(如炎症、缺血、缺氧、创伤、疼痛等),腺苷浓度大幅度上升。腺苷广泛的生物学效应主要由腺苷受体介导,目前已知的腺苷受体(adenosine receptor,AR)有4种亚型,分别为A1、A2A、A2B、A3,均属于G-蛋白偶联受体,可以与相应的G蛋白结合,进而调节腺苷酸环化酶、离子通道和磷脂酶的活性。在对心血管疾病和肾脏疾病的研究中发现,腺苷对心肌细胞和肾基底膜细胞的钾离子通道具有调节作用,同时腺苷受体激动剂和拮抗剂对于治疗中枢神经系统神经退行性病变(如帕金森病和阿尔茨海默病等)的研究也显示了良好的前景。本课题研究的目的在于阐明腺苷及其受体对青光眼状态下视网膜Müller细胞的钾离子通道和视网膜谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)、谷氨酸天冬氨酸转运体(L-Glutamate/L-Aspartate Transporter,GLAST)的调控,为青光眼视神经保护提供理论依据和实验基础。目的:观察腺苷及其受体对慢性高眼压大鼠视网膜Müller细胞钾离子通道以及视网膜GS和GLAST是否具有调控作用;为发掘青光眼的视神经保护方法和治疗靶点提供实验依据,丰富青光眼视神经损害的作用机制。方法:通过对Sprague Dawley(SD)大鼠3条巩膜上静脉结扎和前房内注射微珠,制作了两种大鼠慢性高眼压模型。通过检测眼压变化和Di I逆标视网膜神经节细胞(RGCs)观察RGCs丢失情况,对两种模型进行评估研究。采用Realtime-PCR、Western blot和免疫荧光标记等方法研究大鼠慢性高眼压状态下视网膜Müller细胞和离体加压培养的视网膜Müller细胞的钾离子通道Kir2.1、Kir4.1、TASK-1、GS和GLAST的表达变化情况。慢性高眼压大鼠玻璃体腔和体外加压培养的视网膜Müller细胞分别给予腺苷、腺苷+腺苷受体A1拮抗剂8-cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine(DPCPX)、腺苷+A2A受体拮抗剂SCH442416和腺苷+A3受体拮抗剂MRS 1191进行干预(药物终浓度分别为腺苷10μM、腺苷10μM+DPCPX 10μM、腺苷10μM+SCH442416 100n M、腺苷10μM+MRS1191 10μM),采用Realtime-PCR、Western blot和免疫荧光标记等方法检测视网膜及Müller细胞Kir2.1、Kir4.1、TASK-1、GS和GLAST m RNA和蛋白的表达变化。应用膜片钳记录分离的视网膜Müller细胞电流,观察SCH442416对视网膜Müller细胞钾离子通道电流的调控。结果:巩膜上静脉结扎和前房微珠注射均能建立有效和稳定的高眼压模型,巩膜上静脉结扎法更为方便且对眼内环境干扰更少。大鼠慢性高眼压眼视网膜钾离子通道Kir2.1、Kir4.1、TASK-1 m RNA和蛋白表达较对照眼不同程度的下降,慢性高眼压后2、4、8周,与对照组相比,实验眼视网膜Kir2.1蛋白表达分别降低了13.5%、22.8%和22.0%,差异有统计学意义(n=6,P=0.000、0.000和0.000);Kir4.1蛋白表达分别下降了35.7%、51.8%和40.6%,差异有统计学意义(n=6,P=0.08、0.000和0.000);TASK-1的蛋白表达分别降低了21.6%、22.7%和37.0%,差异有统计学意义(n=6,P=0.000、0.000和0.000);GS蛋白表达分别降低了20.0%、23.6%和17.9%,差异有统计学意义(n=6,P=0.014、0.005和0.026);GLAST蛋白表达则分别降低了35.0%、42.1%和38.6%,差异有统计学意义(n=6,P=0.000、0.000和0.000)。实验眼视网膜Kir2.1 m RNA表达较对照眼分别降低了22.4%、26.0%和59.0%(n=6,P=0.010、0.005和0.005);Kir4.1 m RNA表达分别降低了20.7%、39.8%和51.1%(n=6,P=0.005、0.011和0.001);TASK-1m RNA表达分别降低了19.9%、18.1%和61.2%(n=6,P=0.017、0.042和0.036);GS m RNA分别降低了16.0%、10.4%和27.4%(n=6,P=0.004、0.033和0.000);GLAST m RNA表达分别降低了38.2%、51.2%和49.7%(n=6,P=0.003、0.000和0.009)。免疫荧光双标染色显示Kir2.1主要分布于Müller细胞突触末梢与胞体间的胞膜上,与GS表达位置相同;Kir4.1主要位于Müller细胞近玻璃体侧的终足、外丛状层、血管周围的胞膜区域及微绒毛上,与GS在终足和丛状层的表达位置一致;TASK-1主要分布于Müller细胞终足与胞体间的胞膜上及微绒毛上,与GS在终足和胞体之间的表达位置一致。免疫荧光染色显示慢性高眼压后2、4、8周Müller细胞Kir2.1、Kir4.1、TASK-1和GLAST的表达量较对照眼下降,与Western blot显示的结果一致。大鼠慢性高眼压眼璃体腔内注射腺苷组、腺苷+DPCPX组和腺苷+MRS1191组视网膜Kir2.1、Kir4.1和TASK-1的蛋白表达分别与对照组(单纯慢性高眼压眼)相比,差异无统计学意义(n=6,P=0.243、0.249、0.121;P=0.194,、0.536、0.979;P=0.68、0.81、0.52),腺苷+SCH442416组视网膜Kir2.1、Kir4.1和TASK-1的蛋白表达分别较对照组增加了0.1%、120.9%和79.3%,经统计学分析,Kir4.1和TASK-1蛋白表达增加,差异具有统计学意义(n=6,P=0.01、P=0.000),而Kir2.1的蛋白表达增加无统计学意义(n=6,P=0.983)。腺苷组GS和GLAST的蛋白表达较对照组分别下降6.3%和34.7%,经统计学分析,差异有统计学意义(n=6,P=0.03;P=0.000)。腺苷+DPCPX组与对照组相比,GS蛋白表达下降了5.8%,差异有统计学意义(n=6,P=0.042),而GLAST蛋白表达的改变,差异无统计学意义(P=0.438)。腺苷+MRS1191组视网膜GS和GLAST的蛋白表达与对照组相比,差异无统计学意义(n=6,P=0.071;P=0.208)。腺苷+SCH442416组视网膜GS和GLAST的蛋白表达较对照组增加了48.3%和42.8%,差异具有统计学意义(n=6,P=0.000;P=0.000),表明SCH442416对慢性高眼压眼视网膜Kir4.1、TASK-1、GS和GLAST的蛋白表达具有调控作用。腺苷组、腺苷+DPCPX组和腺苷+MRS1191组视网膜Kir2.1、Kir4.1和TASK-1 m RNA表达分别与对照组相比,差异无统计学意义(n=6,P=0.788、0.994、0.577;P=0.982、0.997、0.231;P=0.498、0.051、0.090),表明腺苷、DPCPX和MRS1191对慢性高眼压眼视网膜Kir2.1、Kir4.1和TASK-1 m RNA表达无明显影响。腺苷+SCH442416组视网膜Kir2.1 m RNA表达较对照组下降1.1%,差异无统计学意义(n=6,P=0.998);Kir4.1和TASK-1 m RNA表达分别较对照组增长了105%和35.8%,差异有统计学意义(n=6,P=0.011、P=0.004)。腺苷组视网膜GS和GLAST m RNA表达较对照组分别下降17.3%和29.5%,经统计学分析,GS m RNA表达变化,差异无统计学意义(n=6,P=0.070),而GLAST m RNA表达变化,差异有统计学意义(n=6,P=0.045);腺苷+DPCPX对视网膜GS和GLAST m RNA表达无明显影响(n=6,P=0.050;P=0.680)。腺苷+MRS1191组GS m RNA表达变化,差异无统计学意义(n=6,P=0.589),而GLAST m RNA表达变化,差异有统计学意义(n=6,P=0.014)。腺苷+SCH442416组视网膜GS和GLAST m RNA表达较对照组分别增加46.2%和159%,差异有统计学意义(n=6,P=0.000;P=0.003),表明SCH442416对慢性高眼压眼视网膜Kir4.1、TASK-1、GS和GLAST m RNA表达具有调控作用。免疫荧光染色显示,与对照组和腺苷组相比,腺苷+SCH442416组GS蛋白在Müller细胞终足部位的表达有增强,GLAST蛋白表达整体增强,Kir2.1蛋白表达无明显变化,Kir4.1在外丛状层和终足表达增强,TASK-1蛋白表达整体增强。40 mm Hg/24h加压培养可致视网膜Müller细胞钾离子通道Kir2.1、Kir4.1和TASK-1的蛋白表达下调,与对照组相比分别下降了14.7%、38.6%和52.6%,差异有统计学意义(P=0.082、P=0.000、P=0.000);40 mm Hg/24h+腺苷+SCH442416组视网膜Müller细胞Kir4.1和TASK-1的蛋白表达较40 mm Hg/24h组上调,分别上升了8.8%、60.7%和61.4%,差异有统计学意义(P=0.354、P=0.000、P=0.000)。40mm Hg/24h加压培养可致视网膜Müller细胞Kir2.1、Kir4.1和TASK-1 m RNA表达较对照组下调,差异有统计学意义(n=6,P=0.047;P=0.002;P=0.047),而40mm Hg/24h+腺苷+SCH442416组的Kir4.1和TASK-1的表达有上调,差异有统计学意义(n=6,P=0.038;P=0.030)。膜片钳记录分离的大鼠视网膜Müller细胞电流显示,实验组钾离子电流峰值较对照组的峰值下降45.4%,经统计学分析,差异有统计学意义(n=6,P=0.005)。腺苷+SCH44241组钾离子内向电流峰值较单纯慢性高眼压组升高,差异有统计学意义(n=6,P=0.014),表明SCH442416对慢性高眼压大鼠视网膜Müller细胞钾离子电流具有调控作用。结论:(1)本实验建立了稳定的大鼠慢性高眼压模型。(2)慢性高眼压可致视网膜Müller细胞Kir2.1、Kir4.1、TASK-1、GS和GLAST的蛋白和m RNA表达下调(3)SCH442416对慢性高眼压眼视网膜Müller细胞Kir4.1、TASK-1、GS和GLAST的蛋白和m RNA表达具有调控作用;(4)慢性高眼压可致视网膜Müller细胞钾离子内向整流电流明显降低;(5)腺苷+SCH442416可以调控视网膜Müller细胞钾离子内向整流电流。