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L-亮氨酸作为人体必需的八种氨基酸之一,不仅是构成蛋白质的基本单位,而且具有特殊的生理、生物学功能,因而广泛应用于食品、医药、饲料等领域,具有很好的应用前景。目前工业生产中主要通过微生物发酵法合成L-亮氨酸,而谷氨酸棒状杆菌是应用最广泛的菌种。本论文以谷氨酸棒杆菌野生型菌株ATCC 13032为出发菌株,结合代谢工程的相关理论,运用基因工程手段以及分子生物学技术,并根据菌种选育和工艺控制的五字策略“进通节堵出”进行分析,最终构建了一株具有工业化价值的L-亮氨酸工程菌AL14,主要内容和结果如下:1、L-缬氨酸合成途径是合成L-亮氨酸的必经途径,为强化L-缬氨酸合成途径,本论文引入了 L-缬氨酸生产菌XV中的乙酰羟酸合酶编码突变基因ilvBNXV并进行双拷贝以解除L分支链氨基酸对关键酶乙酰羟酸合酶的反馈抑制作用,构建菌株AL02,并经36 h摇瓶发酵,其L-缬氨酸产量达到18 g/L,是出发菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的22.5倍。乙酰羟酸合酶的引入有效地降低了终产物的反馈抑制作用,L-亮氨酸合成前体物已得到较强供应,这为下一步的L-亮氨酸合成途径的分子改造工作奠定了基础。2、在L-缬氨酸合成途径强化的基础下,为将更多的碳代谢流导入L-亮氨酸合成途径,本论文对L-亮氨酸合成途径基因进行了强化表达:①引入了 L-亮氨酸生产菌CP中的异丙基苹果酸合酶编码突变基因leuACP,解除L-亮氨酸对关键酶异丙基苹果酸合酶的反馈抑制作用,并在基因组上整合三个基因拷贝以增强该酶的表达;②强化了 L-亮氨酸合成途径中的异丙基苹果酸异构酶和异丙基苹果酸脱氢酶的表达,增强L-亮氨酸合成途径代谢流;③引入了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中的亮氨酸脱氢酶,增强L-亮氨酸合成的转氨反应,减少L-亮氨酸合成对还原力NADPH的需求。构建的L-亮氨酸工程菌AL10,经36 h摇瓶发酵,L-亮氨酸产量达到11.6 g/L,与出发菌株ATCC 13032相比,提高了 18.3倍。发酵液中检测到的主要副产物是L-缬氨酸,这说明虽然L-亮氨酸合成途径已强化,但异丙基苹果酸合酶酶活仍然需要增强。3、NADPH是细胞内重要的还原力,L-亮氨酸的合成对NADPH的需求量高。为了提高胞内NADPH的供应,促进L-亮氨酸的积累,本论文引入了大肠杆菌（Escherichia coli）中的吡啶核苷酸转氢酶编码基因pntAB.由启动子PgapA控制转录。构建了L-亮氨酸工程菌AL11,该菌株经36 h摇瓶发酵,L-亮氨酸产量达到12.5 g/L,是出发菌株的19.8倍。由此可以看出,异源表达大肠杆菌的吡啶核苷酸转氢酶强化了L-亮氨酸的合成。4、丙酮酸是分支链氨基酸合成的主要前体物。为增强胞内的丙酮酸供应,本论文敲除了苏氨酸脱氢酶编码基因ilvA,切断了 L-异亮氨酸合成途径,构建了 L-亮氨酸工程菌AL12。在发酵培养基中回补适量L-异亮氨酸,经36h摇瓶发酵,AL12的L-亮氨酸产量6.3 g/L,与AL11菌株相比,L-亮氨酸产量降低了一倍。另外,AL12的生长周期明显延长,生物总量也出现明显下降,表明L-异亮氨酸合成途径的阻断,影响了菌体的正常生长及发酵产酸。5、三羧酸循环（TCA）途径是谷氨酸棒杆菌中碳分解代谢的主要途径之一,为在不影响菌体正常生长的情况下,进一步减少L-亮氨酸前体物丙酮酸的消耗,本论文将TCA中柠檬酸合酶启动子替换为L-亮氨酸生产菌CP中的特异性启动子PCP2928,从而使碳源在乙酰辅酶A代谢节点上流向TCA循环的通量降低,成功构建L-亮氨酸工程菌AL13。经36h摇瓶发酵,AL13的L-亮氨酸产量达13±0.1 g/L,比出发菌株提升了 21倍,由此说明,该策略在一定程度上起到了弱化TCA循环的作用,将更多的碳源导入了 L-亮氨酸的合成途径。6、为了进一步增强异丙基苹果酸合酶活性,本论文进一步将异丙基苹果酸合酶编码突变基因leuACP克隆到质粒上,并导入AL13中,增强异丙基苹果酸合酶的表达,构建L-亮氨酸工程菌AL14。经过36 h摇瓶发酵,L-亮氨酸产量达到26 g/L,与出发菌株相比提高了 42.3倍。7、为了综合考察L-亮氨酸工程菌AL14的生产能力,本论文利用5 L发酵罐进行了分批补料发酵实验,经48 h分批补料发酵,L-亮氨酸产量达到39.8 g/L,糖酸转化率为15.8%。该菌株已具备良好的工业化生产潜力。