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背景和目的:目前临床上最有效的治疗急性肝功能衰竭(acute liver failure,ALF)方法仅限于肝移植,而肝移植由于组织器官来源匮乏,治疗成本高,风险大等缺陷限制其广泛展开,因而ALF仍然是国际上急待解决的重大医学难题。采用由干细胞分化而来的功能性肝细胞治疗ALF成为新的研究方向。人孤雌胚胎干细胞(human parthenogenetic embryonic stem cells,hPESCs)不仅与人胚胎干细胞一样具有强大的分化潜能和高度自我更新能力,而且可以有效避免伦理学争议和免疫排斥等问题,具有着优越的应用前景。hPESCs来源的肝细胞成为解决临床肝移植治疗中组织来源紧缺问题的新方法。为此本研究拟针对hPESCs体外人工定向诱导分化为功能性肝细胞的可行性进行初步探索。方法:1、采用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化原代培养获得鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)。2、建立体外培养hPESCs的三种不同培养体系:hPESCs/MEF(以MEF为饲养层)培养体系、hPESCs/hFF(以hFF为饲养层)培养体系、hPESCs/3T3(以3T3为饲养层)培养体系。观察hPESCs在不同体系中的生长状态,使用形态学观察法和碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AKP)法检测hPESCs在三种培养体系中是否能够稳定生长并保持未分化状态。3、通过联合使用活化素A(ActivinA)、成纤维细胞生长因子4(fibroblast growth factor-4,FGF-4)、骨形成蛋白 2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、制瘤素(oncostatin M,OSM)、地塞米松(dexamethasone,Dex)、B27七种诱导因子分阶段促使hPESCs向肝细胞分化。对诱导分化过程中的各个阶段的细胞形态变化做记录并通过逆转录实时荧光定量PCR技术(quantitative real-timeRT-PCR,RT-qPCR)检测限定性内胚层(definitive endoderm,DE)特异性基因Sox17和Gsc的相对表达量以及肝细胞特异性基因AFP与ALB的相对表达量,在诱导末期通过免疫细胞化学法(immunocytochemistry,ICC)检测肝细胞标志蛋白CK18和Hepa的表达情况,同时通过吲哚菁绿(indocyanine green,ICG)染色、糖原PAS染色和细胞培养上清液中甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)、白蛋白(albumin,ALB)与尿素含量的检测判定诱导后的细胞是否具有肝细胞功能。结果:1、经原代培养成功获得了 MEF,通过形态学观察和后续hPESCs/MEF培养体系中的hPESCs生长状态验证符合MEF的细胞生物学特性。2、hPESCs/MEF、hPESCs/hFF 和 hPESCs/3T3 三种培养体系中的 hPESCs 均生长良好,经体外培养超过20代仍能保持hPESCs生物学特性,自发分化率均小于5%,生长速度稳定。3、hPESCs/hFF培养体系采用人源性饲养层,相对其他两种培养体系排除了动物源性污染问题,更符合研究目的,具有其他动物源性培养体系不具备的优势。4、RT-qPCR检测结果显示:撤去bFGF与饲养层的培养体系后,DE特异性基因Sox17与Gsc表达量显著升高,Soxl7与Gsc在实验组诱导第2天时相对表达量最高。在诱导末期,肝细胞特异性基因AFP与成熟肝细胞特异性基因ALB相对表达量最高;免疫组化结果显示:诱导末期肝细胞特异性蛋白CK18与Hepa呈阳性表达,定位于胞质;ICG染色结果显示:诱导后的细胞具有代谢染料的功能;糖原PAS染色结果显示:诱导后的细胞糖原呈红色,定位于胞质;对细胞培养上清中AFP、ALB与尿素含量检测结果显示:与对照组相比,经诱导后的细胞培养上清液中AFP、ALB与尿素含量显著升高。结论:1、通过0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液消化法原代培养成功获得MEF。2、hPESCs/MEF体系、hPESCs/hFF体系和hPESCs/3T3体系适宜条件下均能有效支持hPESCs的增殖并维持其未分化状态,其中hPESCs/hFF体系为人源性培养体系,避免了动物源性污染,在应用前景上更具有优势。3、bFGF与饲养层的培养体系能显著抑制hPESCs自发分化,Activin A可促进hPESCs向DE分化。4、联合使用诱导因子 Activin A、FGF-4、BMP-2、HGF、OSM、Dex、B27,通过分阶段诱导分化方法,能够将hPESCs诱导分化为在细胞形态学、肝细胞特异性基因、标志蛋白和肝功能均与正常肝细胞十分相似的肝细胞样细胞。