论文部分内容阅读
研究背景：大肠癌(Colorectal cancer, CRC)是常见的消化道恶性肿瘤,每年约有40万男性和38万女性罹患此病。尽管通过早期筛查及结肠腺瘤摘除手术,CRC相关死亡率已有明显下降,但每年仍有约39万名患者死于该病,相对存活率不到40%。其中肿瘤转移是CRC致死的主要原因之一。Claudin-7是一种紧密连接蛋白。研究表明,claudin-7表达上调促进了CRC患者癌细胞的转移和扩散。因此,在本研究中,我们探讨了通过RNA干扰技术(RNA interference, RNAi)和CpG甲基转移酶(M.SssI)两种方法下调claudin-7表达是否会对CRC细胞的凋亡增殖产生影响,从而为CRC的治疗提供新的思路。目的：探讨CpG甲基转移酶(M.SssI)和RNA干扰技术(RNAi)对膜相关紧密连接蛋白claudin-7表达及CRC细胞凋亡和增殖的影响。方法：1.采用重亚硫酸盐测序法(Bisulfite Sequencing PCR, BSP)分析M.SssI,磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline, PBS)及甲基化酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-Azacytidine,5-Aza)作为抑制甲基化组,测定处理后的CRC细胞HT-29中紧密连接蛋白claudin-7基因启动子区域CpG岛的甲基化状况。2.应用实时荧光定量PCR、 Western blot、细胞免疫荧光法检测CRC细胞HT-29及HCT-116中claudin-7mRNA及蛋白表达水平。3.利用流式细胞术及Hoechst33342荧光染色法检测HT-29、 HCT-116细胞的凋亡,应用Cell CountingKit-8(CCK-8)检测HT-29、 HCT-116细胞的增殖。结果：1.与Control组相比较,M.SssI处理过的CRC HT-29细胞中发生甲基化的claudin-7基因启动子区域CpG岛数量显著增加,而5-Aza处理过的细胞中甲基化CpG数量明显下降。2. M.SssI、 RNAi显著下调了HT-29和HCT-116细胞中claudin-7在mRNA及蛋白水平的表达。3.流式细胞术提示M.SssI及RNAi明显增加了HT-29、HCT-116细胞的早期凋亡率。此外,Hoechst3334荧光染色也表明,PBS及5-Aza组的HCT-116细胞呈均匀蓝色荧光,细胞呈圆形,大小一致,无明显差异,而用M.SssI处理过的细胞呈现高度白色荧光。相反地,CCK-8检测表明M.SssI及RNAi处理过的HCT-116、HT-29细胞生长明显慢于对照组。结论：M.SssI及RNAi可以在不同水平减少claudin-7表达,诱导CRC细胞的凋亡及抑制其增殖。