手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)主要由肠道病毒71型(entero virus71, EV71)引起,临床特征主要为发热,手、足、口腔等部位出现皮疹或疱疹和疱疹性咽峡炎等。手足口病以婴幼儿发病为主,少数病患可出现神经系统症状,包括无菌性脑膜炎、急性弛缓性麻痹和脑干脑炎,并常伴有系统性临床体征,如严重的肺水肿和休克。东南亚国家为HFMD流行的重灾区。尤其在20世纪90年代后期,HFMD在马来西亚、台湾、新加坡、日本、越南等地发生了一系列的爆发流行。2008年,我国曾爆发了亚太地区最大规模的HFMD流行,约有49万感染者,126名儿童死亡。目前,该病尚无特异性治疗手段,主要采用广谱的抗病毒药物治疗,亦尚无有效的疫苗可以使用。因此,研制安全有效的预防用疫苗是应对HFMD疫情爆发的迫切需要,也是控制]HFMD流行的重要手段。“粪-口”途径是EV71病毒主要传播途径,因此通过粘膜免疫诱导产生粘膜特异性抗体和细胞免疫反应进而阻断病毒感染是可行的。并且,粘膜免疫相比传统免疫策略具有更为安全、经济,且易于为目标人群所接受和大规模人群接种等诸多优点,近年来逐渐引起疫苗学家的兴趣和重视。已有研究报道,EV71病毒主要线性中和表位和CD4+T细胞表位均位于VP1蛋白上面,VP1蛋白肌注免疫可以诱导产生保护性免疫反应,是一种潜在的亚单位疫苗。因此,本研究选用口服途径进行免疫,探讨基于VP1蛋白口服疫苗的免疫原性及保护效果。本研究中,我们选用中国流行株——EV71病毒C4亚型作为疫苗候选株。首先,利用大肠杆菌表达系统表达VPl蛋白,通过SDS-PAGE鉴定该基因工程重组VPl蛋白分子量约为36KD,与天然病毒VP1蛋白分子量相似,并通过Western blot利用VP1蛋白单克隆抗体进行了鉴定。将纯化的VP1蛋白与壳聚糖溶液制备成均质溶液即为VP1蛋白口服疫苗,并分别在兔子和小鼠模型中对其免疫原性及保护效果的进行初步评价。我们在新西兰兔子模型中对该口服疫苗的免疫原性进行了初步研究。结果显示,该口服疫苗具有较好的免疫原性,各免疫组均可诱导产生血清特异性IgG抗体,其中高剂量组诱导产生的IgG抗体最高可达1：10240。与壳聚糖配伍的高、低剂量口服疫苗免疫组均诱导产生了中和抗体。在小肠、阴道、鼻腔、肺粘膜灌洗液中均可检测到特异性IgA抗体,此外在小肠粘膜表面还检测到了IgG抗体反应。分(?)的脾细胞经体外刺激培养后,对细胞培养上清中的细胞因子水平进行检测,结果显示免疫组动物的脾细胞分泌IFN-γ和IL-4水平明显升高,说明口服免疫亦可诱导细胞免疫反应。另外,我们在ICR小鼠模型中进一步评价了该口服疫苗的免疫原性和攻毒保果，研究显示,VP1蛋白口服免疫ICR小鼠可刺激产生血清特异性IgG抗体和中和抗体,含佐剂高剂量免疫组诱导产生的中和抗体滴度为1：8。除粪便外,还在小肠、呼吸道和阴道粘膜洗液中检测到特异性IgA及IgG抗体。免疫组动物脾细胞经体外刺激后,细胞因子IFN-γ、IL-4和TGF-β分泌水平明显高于对照组,说明该口服疫苗诱导产生的免疫反应为Th1(IFN-γ)、Th2(IL-4)和Th3(TGF-β)型。为评价口服疫苗诱导产生的粘膜抗体的保护效果,本研究中将EV71病毒经灌胃途径攻击免疫后的成年ICR小鼠,虽然未有明显的临床表现,但是免疫组小鼠粪便中的排毒量和排毒时间明显小于对照组,表明口服疫苗对于保护乳鼠抵抗经肠道的EV71病毒感染是有效的。此外,我们还评价了母传抗体对乳鼠的保护效果,结果显示母传抗体可以保护乳鼠抵抗经颅腔103PFU的病毒攻击,高剂量免疫组保护率为30%。综上所述,本研究通过大肠杆菌表达系统成功表达纯化了EV71病毒VPl蛋白,在新西兰兔子和小鼠模型中对VP1蛋白口服疫苗的免疫原性和保护效果进行了初步研究。结果显示基因工程重组VP1蛋白口服疫苗能够刺激兔子和ICR小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫应答；肠粘膜表面特异性抗体可以保护小鼠抵抗经肠道病毒感染；母传抗体可以保护30%的乳鼠抵抗致死剂量的病毒攻击。本研究对EV71病毒口服疫苗的研发具有一定的指导意义。