目的：Bmal1基因又名MOP3或ARNTL(aryl-hydrocarbon receptor nuclear translocator like protein)，是重要的转录因子，于1997年被实验人员成功克隆。Bmal1基因包含Per-ARNT-Sim(PAS)和bHLH(basic Helix-Loop-Helix)结构域，具有结合DNA并作为转录因子调控基因转录的功能。多种模式生物中均存在Bmal1同源基因。其中，大鼠Bmal1基因定位于1号染色体。利用报告基因系统，发现Bmal1转录起始位点上游816bp到转录起始位点下游99bp区段的转录活性最强。序列比对发现，这一区段含有多个转录因子的结合位点，对于Bmal1转录至关重要的因子也结合于这一区域。最新研究表明DNA甲基化对于Bmal1的转录发挥着核心调控作用，而受甲基化调控的CpG岛也位于上述915bp区段。因此，该915bp的区段被广泛用于Bmal1基因转录活性的研究。Bmal1基因并非在所有的组织或细胞中均有表达。本实验室的研究成果表明，胚胎干细胞在Bmal1的表达层面即表现出异质性。一部分细胞表现为Bmal1基因阳性，另一部分细胞表现为Bmal1阴性。这种异质性在胸腺和睾丸中也有所体现。目前尚无有效的方法能够将Bmal1阳性和阴性的细胞区分筛选出来并进行后续的研究。本课题为了解决这一技术瓶颈，利用基因工程的方法和技术构建pLV-Bmal1-mCherry-EF1-copGFP-T2A-puro双荧光载体。使我们可以很便利的研究Bmal1启动子在活体细胞和组织的生物学特性。方法：我们首先明确Bmal1基因启动子区段。该启动子起始于转录起始位点上游816位碱基，延伸至转录起始位点下游99位碱基，全长915个碱基。这一区段含有多个转录因子的结合位点，包括SP1, AP1, NF-Y。Rev-erb alpha, Rev-erb beta, RORa, RORb等对于Bmal1转录至关重要的因子也结合于这一区域。对于Bmal1的转录发挥着重要调控作用的DNA甲基化影响的也是这一区段。该915bp的区段被广泛用于Bmal1基因转录活性的研究。我们使用高保真酶，以小鼠肝脏基因组DNA为模板，扩增Bmal1启动子序列。通过双酶切将Bmal1基因启动子克隆到慢病毒载体pLV-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-puro中，从而得到中间克隆pLV-Bmal1-MCS-EF1-copGFP-T2A-puro。而后再次通过双酶切，将红色荧光蛋白（mCherry）克隆入pLV-Bmal1-MCS-EF1-copGFP-T2A-puro中，从而得到最终目的克隆pLV-Bmal1-mCherry-EF1-copGFP-T2A-puro。将该克隆与pLP1、pLP2、pLP3，共同转染293T细胞，进行病毒包装。收获病毒并经超离心纯化获得浓缩病毒。获得的病毒感染293T细胞检测病毒滴度。结果：以小鼠基因组DNA为模版，扩增得到Bmal1基因启动子区段。经过两步克隆成功最终目的克隆pLV-Bmal1-mCherry-EF1-copGFP-T2A-puro，酶切和测序证实结构正确。该克隆中存在两套报告基因系统，其中红色荧光蛋白的转录为Bmal1启动子所控制，绿色荧光蛋白的转录为组成型启动子EF1所控制。之所以这样设计，是考虑到慢病毒感染细胞的效率可能达不到100%。由于EF1几乎表达于所有种类的组织和细胞，当病毒成功感染靶组织或细胞时，细胞将表达绿色荧光蛋白，并发绿光。而未受病毒感染的细胞将不表达绿色荧光蛋白，从而不发光。只有发绿光的细胞才被认为是病毒成功感染的细胞，也才会进一步分析其中红色荧光蛋白的表达情况，既Bmal1基因的表达情况。通过这种设计避免了区分和筛选时的假阴性。使用该克隆包装的病毒感染HEK293细胞，经病毒滴度检测其滴度达到3*108TU/mL，可以用于后续感染实验。结论:本实验成功构建了含受Bmal1启动子调控的红色荧光蛋白慢病毒载体，并成功获得了高滴度病毒。为区分Bmal1阳性和阴性细胞，并分析其生物学特性的异同打下了坚实的基础。