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第一部分LncRNAHOTTIP在鼻咽癌中的表达情况及生物学作用
研究背景
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一种起源于人体鼻咽粘膜上皮的恶性肿瘤，好发于鼻咽顶后壁和侧壁，属于头颈部常见的恶性肿瘤;而在全球广大区域范围内，NPC这种恶性肿瘤发病范围和地域主要集中分布于北非、东南亚和中国南部，发病率相对较高。由于NPC对放射高度敏感，放疗已成为早期NPC最有前途和最有效的治疗方法。然而，即使进行了放疗及化疗等多种治疗，晚期NPC患者的生活质量及生存情况仍不令人满意。因此，了解NPC早期发病的主要病理基因分子和机制可能为其诊断和其早期治疗提供全新的研究方向。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在多种疾病的发展中，特别是恶性肿瘤的发生发展及生物学特性中，发挥重要作用，得到广泛的关注。本课题旨在探讨lncRNAHOXA远端转录本(HOXA transcript at the distal tip，HOTTIP)在鼻咽癌中的表达情况和生物学作用，判断其临床表达意义。
研究方法
培养NPC细胞C666-1、SUNE-1及正常的鼻咽粘膜上皮细胞NP69，应用实时定量聚合酶链锁反应(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)技术测定各类鼻咽相关粘膜细胞中HOTTIP的表达水平。收集NPC组织和配对的癌旁组织以及患者的临床资料，利用qRT-PCR技术分析收集到的组织中HOTTIP的表达水平，并利用统计学分析HOTTIP的表达水平与患者临床病理参数及总生存时间之间的关系。利用小干扰RNA及质粒载体转染NPC细胞系，构建HOTTIP沉默和过表达模型，利用CCK-8实验检测NPC细胞内HOTTIP的表达水平对NPC细胞增殖速率的影响，利用流式细胞技术(Annexin-FITC/PI双染法)检测lncRNAHOTTIP对NPC细胞系C666-1和SUNE-1的凋亡率的影响，随后，利用细胞划痕实验、Transwell小室实验分别观察检测HOTTIP表达水平的高低对NPC细胞迁移和侵袭能力的作用影响，蛋白免疫印迹((western blot)技术检测HOTTIP对NPC细胞凋亡概率及上皮间质转化相关蛋白表达的影响。
研究结果
检测2种NPC细胞系与正常鼻咽上皮细胞中HOTTIP的相对表达水平，证实HOTTIP在NPC细胞系中相对表达水平明显上调，显著高于正常鼻咽上皮细胞(P＜0.001);在Ⅲ-Ⅳ期、有淋巴结转移及远处转移的NPC组织中表达水平显著高于Ⅰ-Ⅱ期、无淋巴结转移及无远处转移的NPC组织。卡方检验分析的结果表明，HOTTIP的表达与NPC患者的临床分期、癌细胞有远处转移及有淋巴结转移相关，但是与患者的性别、具体年龄无关。卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier, KM)生存曲线的结果显示，HOTTIP高表达组内患者的总生存率明显低于低表达组内患者的生存率;比例风险模型(proportional hazards model，COX)分析结果显示HOTTIP的表达是影响NPC预后的独立因素。CCK-8实验结果显示敲低HOTTIP后NPC细胞增殖能力显著下降，而过表达HOTTIP可增强NPC细胞的增殖能力(P＜0.05)。流式细胞技术检测结果显示敲低HOTTIP后NPC细胞凋亡率增加，重新过表达HOTTIP可逆转这一现象。同样，细胞划痕实验及Transwell小室实验观察到，沉默HOTTIP使HOTTIP低表达后NPC细胞的迁移、侵袭生物学特性明显受到抑制。Westernblot结果表明HOTTIP影响了NPC细胞凋亡及上皮间质转化相关蛋白的表达水平。
研究结论
LncRNAHOTTIP在NPC患者组织及细胞系中均有明显上调，临床资料与HOTTIP表达水平之间的关系表明HOTTIP在NPC中高表达与多项临床病理参数及患者预后显著正相关，HOTTIP有潜能作为临床病理检测NPC进展并预测患者预后的一个重要标志物。体外细胞实验表明HOTTIP可促进NPC细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学细胞特性，而抑制细胞凋亡。
第二部分LncRNAHOTTIP在鼻咽癌中作用机制的初步研究
研究背景
LncRNA在人类恶性肿瘤中发挥其多样的生物学功能的机制已经得到了越来越多的研究。微小RNA(microRNA，miRNA)基因序列属于一种具有内源性基因表达的单链RNA，这种单链的长度一般在20到25个核苷酸之间。虽然miRNA本身不可以编码任何蛋白质，但可以通过有效地与靶向的信使RNA(messenger RNA，mRNA)序列结合在一起，来抑制目标基因的表达。越来越多的生物学研究证实，lncRNA可以作为内源性miRNA的吸附式“海绵”，通过竞争性地结合单个或多个miRNA应答元件(microRNA response element，MRE)来有效地抑制miRNA的功能，进而导致疾病的发生与发展。HOTTIP可通过miR-455-3p/CCL3、miR-608/DDA1及Wnt/β-catenin等信号通路在多种疾病中发挥重要作用，但HOTTIP在NPC中的作用机制尚不明确。
研究方法
应用qRT-PCR技术对NPC组织和细胞系中miR-4301的表达水平进行检测，并观察HOTTIP对miR-4301表达的影响。利用斯皮尔曼(Spearman)等级相关系数分析NPC组织中HOTTIP与miR-4301表达的相关性。通过荧光素酶报告实验检测HOTTIP与miR-4301之间的关系;沉默HOTTIP后使用qRT-PCR技术检测SUNE-1细胞中miR-4301的表达水平;同时再次转染miR-4301抑制体(miR-4301 in)后，通过CCK-8实验和Transwell小室实验检测NPC细胞SUNE-1的增殖、迁移及侵袭等生物学特性，利用流式细胞术检测SUNE-1细胞的凋亡率。
研究结果
QRT-PCR技术检测NPC组织和细胞系中miR-4301的表达水平，结果发现miR-4301在NPC组织中表达显著低于在正常的癌旁组织中的表达(P＜0.01)，同样地，在NPC细胞系中的表达水平相对于正常鼻咽上皮细胞显著降低(P＜0.05)。斯皮尔曼(Spearman)分析结果显示，HOTTIP与miR-4301的表达呈显著负相关;荧光素酶报告实验结果表明，HOTTIP的基因序列中存在与miR-4301结合的位点。沉默HOTTIP后qRT-PCR技术检测结果显示SUNE-1细胞中miR-4301的表达上调，转染miR-4301in后逆转了miR-4301表达上调情况，并且CCK-8实验和Transwell小室实验结果表明在HOTTIP沉默的SUNE-1细胞中抑制miR-4301的表达可以逆转HOTTIP沉默导致的细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用;流式细胞术结果显示HOTTIP沉默的SUNE-1细胞中抑制miR-4301的表达可以逆转HOTTIP沉默对细胞凋亡的促进作用。
研究结论
在NPC中，HOTTIP可通过MRE与miR-4301结合并负向调控miR-4301的表达，进而发挥促癌作用，有望成为治疗NPC的潜在靶点。
研究背景
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一种起源于人体鼻咽粘膜上皮的恶性肿瘤，好发于鼻咽顶后壁和侧壁，属于头颈部常见的恶性肿瘤;而在全球广大区域范围内，NPC这种恶性肿瘤发病范围和地域主要集中分布于北非、东南亚和中国南部，发病率相对较高。由于NPC对放射高度敏感，放疗已成为早期NPC最有前途和最有效的治疗方法。然而，即使进行了放疗及化疗等多种治疗，晚期NPC患者的生活质量及生存情况仍不令人满意。因此，了解NPC早期发病的主要病理基因分子和机制可能为其诊断和其早期治疗提供全新的研究方向。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在多种疾病的发展中，特别是恶性肿瘤的发生发展及生物学特性中，发挥重要作用，得到广泛的关注。本课题旨在探讨lncRNAHOXA远端转录本(HOXA transcript at the distal tip，HOTTIP)在鼻咽癌中的表达情况和生物学作用，判断其临床表达意义。
研究方法
培养NPC细胞C666-1、SUNE-1及正常的鼻咽粘膜上皮细胞NP69，应用实时定量聚合酶链锁反应(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)技术测定各类鼻咽相关粘膜细胞中HOTTIP的表达水平。收集NPC组织和配对的癌旁组织以及患者的临床资料，利用qRT-PCR技术分析收集到的组织中HOTTIP的表达水平，并利用统计学分析HOTTIP的表达水平与患者临床病理参数及总生存时间之间的关系。利用小干扰RNA及质粒载体转染NPC细胞系，构建HOTTIP沉默和过表达模型，利用CCK-8实验检测NPC细胞内HOTTIP的表达水平对NPC细胞增殖速率的影响，利用流式细胞技术(Annexin-FITC/PI双染法)检测lncRNAHOTTIP对NPC细胞系C666-1和SUNE-1的凋亡率的影响，随后，利用细胞划痕实验、Transwell小室实验分别观察检测HOTTIP表达水平的高低对NPC细胞迁移和侵袭能力的作用影响，蛋白免疫印迹((western blot)技术检测HOTTIP对NPC细胞凋亡概率及上皮间质转化相关蛋白表达的影响。
研究结果
检测2种NPC细胞系与正常鼻咽上皮细胞中HOTTIP的相对表达水平，证实HOTTIP在NPC细胞系中相对表达水平明显上调，显著高于正常鼻咽上皮细胞(P＜0.001);在Ⅲ-Ⅳ期、有淋巴结转移及远处转移的NPC组织中表达水平显著高于Ⅰ-Ⅱ期、无淋巴结转移及无远处转移的NPC组织。卡方检验分析的结果表明，HOTTIP的表达与NPC患者的临床分期、癌细胞有远处转移及有淋巴结转移相关，但是与患者的性别、具体年龄无关。卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier, KM)生存曲线的结果显示，HOTTIP高表达组内患者的总生存率明显低于低表达组内患者的生存率;比例风险模型(proportional hazards model，COX)分析结果显示HOTTIP的表达是影响NPC预后的独立因素。CCK-8实验结果显示敲低HOTTIP后NPC细胞增殖能力显著下降，而过表达HOTTIP可增强NPC细胞的增殖能力(P＜0.05)。流式细胞技术检测结果显示敲低HOTTIP后NPC细胞凋亡率增加，重新过表达HOTTIP可逆转这一现象。同样，细胞划痕实验及Transwell小室实验观察到，沉默HOTTIP使HOTTIP低表达后NPC细胞的迁移、侵袭生物学特性明显受到抑制。Westernblot结果表明HOTTIP影响了NPC细胞凋亡及上皮间质转化相关蛋白的表达水平。
研究结论
LncRNAHOTTIP在NPC患者组织及细胞系中均有明显上调，临床资料与HOTTIP表达水平之间的关系表明HOTTIP在NPC中高表达与多项临床病理参数及患者预后显著正相关，HOTTIP有潜能作为临床病理检测NPC进展并预测患者预后的一个重要标志物。体外细胞实验表明HOTTIP可促进NPC细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学细胞特性，而抑制细胞凋亡。
第二部分LncRNAHOTTIP在鼻咽癌中作用机制的初步研究
研究背景
LncRNA在人类恶性肿瘤中发挥其多样的生物学功能的机制已经得到了越来越多的研究。微小RNA(microRNA，miRNA)基因序列属于一种具有内源性基因表达的单链RNA，这种单链的长度一般在20到25个核苷酸之间。虽然miRNA本身不可以编码任何蛋白质，但可以通过有效地与靶向的信使RNA(messenger RNA，mRNA)序列结合在一起，来抑制目标基因的表达。越来越多的生物学研究证实，lncRNA可以作为内源性miRNA的吸附式“海绵”，通过竞争性地结合单个或多个miRNA应答元件(microRNA response element，MRE)来有效地抑制miRNA的功能，进而导致疾病的发生与发展。HOTTIP可通过miR-455-3p/CCL3、miR-608/DDA1及Wnt/β-catenin等信号通路在多种疾病中发挥重要作用，但HOTTIP在NPC中的作用机制尚不明确。
研究方法
应用qRT-PCR技术对NPC组织和细胞系中miR-4301的表达水平进行检测，并观察HOTTIP对miR-4301表达的影响。利用斯皮尔曼(Spearman)等级相关系数分析NPC组织中HOTTIP与miR-4301表达的相关性。通过荧光素酶报告实验检测HOTTIP与miR-4301之间的关系;沉默HOTTIP后使用qRT-PCR技术检测SUNE-1细胞中miR-4301的表达水平;同时再次转染miR-4301抑制体(miR-4301 in)后，通过CCK-8实验和Transwell小室实验检测NPC细胞SUNE-1的增殖、迁移及侵袭等生物学特性，利用流式细胞术检测SUNE-1细胞的凋亡率。
研究结果
QRT-PCR技术检测NPC组织和细胞系中miR-4301的表达水平，结果发现miR-4301在NPC组织中表达显著低于在正常的癌旁组织中的表达(P＜0.01)，同样地，在NPC细胞系中的表达水平相对于正常鼻咽上皮细胞显著降低(P＜0.05)。斯皮尔曼(Spearman)分析结果显示，HOTTIP与miR-4301的表达呈显著负相关;荧光素酶报告实验结果表明，HOTTIP的基因序列中存在与miR-4301结合的位点。沉默HOTTIP后qRT-PCR技术检测结果显示SUNE-1细胞中miR-4301的表达上调，转染miR-4301in后逆转了miR-4301表达上调情况，并且CCK-8实验和Transwell小室实验结果表明在HOTTIP沉默的SUNE-1细胞中抑制miR-4301的表达可以逆转HOTTIP沉默导致的细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用;流式细胞术结果显示HOTTIP沉默的SUNE-1细胞中抑制miR-4301的表达可以逆转HOTTIP沉默对细胞凋亡的促进作用。
研究结论
在NPC中，HOTTIP可通过MRE与miR-4301结合并负向调控miR-4301的表达，进而发挥促癌作用，有望成为治疗NPC的潜在靶点。