HPV16型E7与EMT之间关系的研究

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【目的】将真核表达质粒psilencer2.1-U6-hyg-shE7和pcDNA3.1-E7分别导入宫颈癌细胞株SiHa、C33a,人为改变两种细胞株中HPV16型E7基因的表达,通过对照研究揭示E7基因表达的变化与EMT之间的关系。【方法】利用已构建的真核表达质粒psilencer2.1-U6-hyg-shE7与pcDNA3.1-E7,分别转染宫颈癌细胞株SiHa、C33a,然后用药物Hygromycin和G418在合适的浓度下筛选,获得能够稳定沉默或者稳定表达E7基因的细胞株SiHa-psilencer2.1-U6hygro、SiHa-psilencer2.1-U6hygro-shE7、C33a-pcDNA3.1(+)及C33a-pcDNA3.1(+)-E7;运用细胞划痕实验和transwell检测细胞系的迁移运动侵袭能力;利用Real-timePCR、Westernblot分别在RNA水平和蛋白水平检测E7基因表达变化与EMT指标之间的变化关系。【结果】1.细胞划痕实验的结果显示:在SiHa-Blank、SiHa-vector及SiHa-shE7这三类细胞中,相对于空白对照和阴性对照来说,E7基因表达被沉默了的SiHa-shE7迁移运动能力明显降低(P<0.05),差异具有统计学意义;另外,在C33a-Blank、C33a-vector及C33a-E7这三类细胞中,相对于空白对照和阴性对照来说,高表达E7基因的C33a-E7迁移运动能力明显升高(P<0.01),差异具有统计学意义。2.Transwell细胞体外侵袭实验发现,SiHa-Blank,SiHa-vector和SiHa-shE7的跨膜细胞数分别为99±3,92±5,70±4;C33a-Blank,C33a-vector和C33a-E7的跨膜细胞数分别为69±2,76±6,93±4。3.Real-timePCR检测各个基因在RNA水平的表达发现,实验组HPV16-E7、E-cadherin、Vimentin相对于空白对照组及阴性对照组来说,差异有极为显著的统计学意义,P<0.001,另外,N-cadherin、FN的相对变化也有统计学意义,P<0.05;C33a组细胞表达量变化:实验组HPV16-E7、N-cadherin、Vimentin相对于空白对照组及阴性对照组来说,差异有极为显著的统计学意义,P<0.001,另外,E-cadherin、FN的相对变化也有统计学意义,P<0.05;4.WesternBlot检测各个基因在蛋白水平的表达发现,SiHa-shE7与SiHa-Blank、SiHa-vector对比观察,HPV16-E7的沉默效应比较明显,同时可见其上皮性标志物E-cadherin表达上调,间质性标记物N-cadherin、Vimentin的表达量下调;C33a-Blank、C33a-vector中HPV16-E7的表达量很低,与C33a细胞株的特性一致(没有感染HPV的宫颈癌细胞株),同时可以观察到C33a-E7相对于C33a-blank、C33a-vector,上皮性标志物E-cadherin表达有明显的下降,间质性标记物N-cadherin的表达有显著的上调,但同样是间质性标记物的Vimentin表达量的变化不明显。【结论】在宫颈癌细胞系SiHa、C33a中,E7基因的高表达能够上调间质性标志物,下调上皮性标志物,从而促进上皮间质化过程。同样的,E7基因表达的沉默或缺失,可以引起上皮性标记物的上调,间质性标记物的下调,阻碍上皮间质化过程。
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