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研究背景功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)是指主要表现为上腹部疼痛、饱胀不适、早饱、嗳气、恶心呕吐等一系列不适症状,而经胃镜等相关检查,排除可以引起上述症状的器质性疾病的一组临床综合征。FD患病率较高,但临床治疗效果有限,严重影响人们的生活质量,同时为医疗系统带来巨大的经济负担。FD发病机制目前尚不明确,多种因素可能参与了其发病,包括胃十二指肠动力异常、近端胃适应性受损、胃十二指肠敏感性增高等多种因素。近年来越来越多的研究发现FD的发生与十二指肠密切相关,尤其是十二指肠的微炎症状态,包括肥大细胞、嗜酸性粒细胞、上皮内淋巴细胞的浸润及炎症因子,如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)局部含量的增高等。而近期的研究发现,十二指肠的机械屏障功能受损,可能与十二指肠微炎症状态及FD的发病之间有重要联系。十二指肠局部炎症因子,如TNF-α/干扰素γ(interferon gama,IFN-γ)含量升高,可激活十二指肠上皮细胞中核转录因子(nuclear factor of kappa b,NF-κB)相关信号通路,进而促进细胞中下游分子,如肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)含量的增加,MLCK可作用于细胞骨架结构,促进细胞骨架收缩,从而连带引起连接于骨架结构上的紧密连接蛋白claudin-1及occludin含量及定位发生改变,同样,iNOS水平的升高,可促进局部NO合成增加,直接造成紧密连接蛋白损伤,进而引起十二指肠上皮细胞细胞旁通路开放,使其机械屏障功能受损;与TNF-α/IFN-γ等炎症因子相反,前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)对胃肠道具有多种调节作用,可以保护胃黏膜、促进十二指肠HCO3-分泌,并且能够通过与PGE2相应的受体(e-series of prostaglandin receptors,EP)结合,激活cAMP-PKA相关通路,促进十二指肠紧密连接蛋白表达,起到对十二指肠机械屏障紧密连接蛋白的保护作用。现代医学对肠道机械屏障及紧密连接蛋白损伤缺少有效的治疗方法,而研究发现部分中药,主要是健脾理气类及清热类中药对肠道紧密连接蛋白的表达具有一定调控作用。健脾理气方是导师根据中医传统理论及临床实践自拟的中药复方,前期临床研究及动物实验均表明,健脾理气方对FD具有良好的治疗效果,但其对FD十二指肠紧密连接蛋白是否有影响及其分子调控机制,目前尚不清楚。因此,本研究对健脾理气方治疗FD及其对十二指肠机械屏障-紧密连接蛋白的调控作用进行研究,并探索其可能的作用机制及信号通路。研究方法实验一:健脾理气方对FD大鼠胃顺应性及敏感性的影响18只SD雄性大鼠随机分为正常组与造模组,采用夹尾刺激方法构建FD模型,造模完成后将造模组大鼠随机分为FD模型组与健脾理气方治疗组,正常组与模型组采用生理盐水灌胃,治疗组大鼠采用健脾理气方水煎剂灌胃,灌胃共7天,每天灌胃1次。灌胃结束后,对18只大鼠进行经口胃内气囊植入术,采用电子恒压器对球囊进行梯度施压:20mmHg、40mmHg、60mmHg、80mmHg,记录各个压力下大鼠胃内气囊体积,用于评价胃顺应性;同时通过其颈部电极记录其斜方肌电生理活动,用以反应内脏敏感性。实验二:健脾理气方对FD大鼠十二指肠黏膜通透性及紧密连接蛋白的影响18只SD雄性大鼠随机分为正常组与造模组,采用夹尾刺激方法构建FD模型,造模完成后将造模组大鼠随机分为FD模型组与健脾理气方治疗组,正常组与模型组采用生理盐水灌胃,治疗组大鼠采用健脾理气方水煎剂灌胃,灌胃共7天,每天灌胃1次。灌胃结束后,对18只大鼠进行2%戊巴比妥钠麻醉并取材,剪取幽门下0.5cm-幽门下3.5cm共3cm长组织。其中一部分组织用于Western blot实验,以测定紧密连接蛋白claudin-1及occludin,剩余新鲜组织用于Ussing chamber实验,通过对跨膜电阻(transepithelial electrical resistance,TEER)的测定,反应十二指肠的紧密连接屏障功能。鬼笔环肽染色技术检测十二指肠黏膜细胞骨架F-actin的表达。实验三:健脾理气方对FD大鼠十二指肠cAMP和NF-κB相关通路的影响18只SD雄性大鼠随机分为正常组与造模组,采用夹尾刺激方法构建FD模型,造模完成后将造模组大鼠随机分为FD模型组与健脾理气方治疗组,正常组与模型组采用生理盐水灌胃,治疗组大鼠采用健脾理气方水煎剂灌胃,灌胃共7天,每天灌胃1次。灌胃结束后,对18只大鼠进行2%戊巴比妥钠麻醉并取材,剪取幽门下0.5cm-幽门下3.5cm共3cm长组织。应用HE染色检测十二指肠的基本形态学改变,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immune sorbent assay,Elisa)检测十二指肠 TNF-α、IFN-γ 及 PGE2、cAMP,Western blot方法检测十二指肠iNOS,qPCR技术检测十二指肠NF-κB、MLCK、PGE2受体EP1/EP4 mRNA表达情况。研究结果实验一:健脾理气方对FD大鼠胃顺应性及敏感性的影响在40mmHg、60mmHg、80mmHg胃内球囊压力刺激下,模型组大鼠胃顺应性指标显著低于正常对照组大鼠(40mmHg:0.18±0.01 vs.0.29±0.01,P<0.01;60mmHg:0.21±0.01 vs.0.31±0.01,P<0.01;80mmHg:0.23±0.01 vs.0.29±0.01,P<0.01),健脾理气方治疗组大鼠胃顺应性明显高于模型组大鼠(40mmHg:0.28±0.01 vs.0.18±0.01,P<0.01;60mmHg:0.31±0.01 vs.0.21±0.01,P<0.01;80mmHg0.29±0.01 vs.0.23±0.01,P<0.01)。而在 20mmHg、40mmHg、60mmHg、80mmHg 胃内球囊压力刺激下,模型组大鼠内脏敏感性指标显著高于正常对照组大鼠(20mmHg:28.05±3.26 vs.12.07±1.58,P<0.01;40mmHg:73.97±7.94 vs.31.77±5.15,P<0.01;60mmHg:196.72±23.55 vs.117.08±14.25,P<0.01;80mmHg:239.65±35.01 vs.114.73±16.91,P<0.01),而健脾理气方治疗组大鼠内脏敏感性较模型组大鼠显著降低(20mmHg:15.47±2.20 vs.28.05±3.26,P<0.01;40mmHg:31.67±4.37 vs.73.97±7.94,P<0.01;60mmHg:111.54±8.90 vs.196.72±23.55,P<0.01;80mmHg 135.83± 19.27 vs.239.65±35.01,P<0.01)。实验二:健脾理气方对FD大鼠十二指肠黏膜通透性及紧密连接蛋白的影响Ussing chamber结果显示,相比与正常对照组大鼠,模型组大鼠十二指肠TEER明显下降(20.21±0.88 vs.39.72±0.60,P<0.01)。Western blot 结果同样显示,模型组大鼠十二指肠紧密连接蛋白claudin-1及occludin表达量显著下调(claudin-1:0.02±0.01 vs.0.07±0.01,P<0.01;occludin:0.05±0.01 vs.0.14±0.01,P<0.01);而健脾理气方治疗后,FD大鼠十二指肠的TEER得到恢复(37.03± 1.61 vs.20.21±0.88,P<0.01),与模型组大鼠相比有显著性差异,并且claudin-1及occludin蛋白的表达同样得到改善(claudin-1:0.07±0.01 vs.0.02 ± 0.01,P<0.01;occludin:0.16±0.01 vs.0.05±0.01,P<0.01)。而鬼笔环肽染色显示,细胞骨架中的微丝蛋白F-actin在三组大鼠中的表达未见显著差异。实验三:健脾理气方对FD大鼠十二指肠cAMP和NF-κ B相关通路的影响Elisa结果显示,与正常组大鼠相比,FD模型组大鼠十二指肠炎性因子TNF-α/IFN-γ含量均显著升高(TNF-α:1.54±0.11 vs.0.79±0.05,P<0.01;INF-γ:0.37±0.02 vs.0.15±0.02,P<0.01),下游信号分子 NF-κB mRNA 及 MLCK mRNA、iNOS蛋白同样显著升高(NF-κB:1.28±0.10 vs.1.01±0.05,P<0.05;MLCKmRNA:1.59±0.12 vs.1.01 ±0.07,P<0.01;iNOS:0.12±0.01 vs.0.07±0.01,P<0.01);而十二指肠 PGE2 含量明显降低(0.74±0.08 vs.1.35±0.06,P<0.01),同时,PGE2受体EP4 mRNA及胞内第二信使cAMP含量显著降低(EP4 mRNA:0.43±0.11 vs.1.09±0.18,P<0.05;cAMP:10.86±0.20 vs.14.38±0.35,P<0.05);而治疗组大鼠在健脾理气方治疗后,其十二指肠炎性因子TNF-α/IFN-γ显著下降(TNF-α:0.83±0.06 vs.1.54±0.11,P<0.01;IFN-γ:0.14±0.02 vs.0.37±0.02,P<0.01),与模型组相比差异显著,NF-κ B mRNA及MLCK mRNA、iNOS蛋白同样明显降低(NF-κB:0.98±0.07 vs.1.28±0.10,P<0.05;MLCK mRNA:0.84±0.09 vs.1.59±0.12,P<0.01;iNOS:0.07±0.01 vs.0.12±0.01,P<0.01),而 PGE2 含量显著升高(1.26±0.04 vs.0.74±0.08,P<0.01),EP4 mRNA 水平及 cAMP 含量明显升高(EP4 mRNA:1.11±0.19 vs.0.43±0.11,P<0.05;cAMP:14.01 ±0.30 vs.10.86±0.20,P<0.01)。而PGE2的受体EP1在三组间未见统计学差异(P>0.05)。研究结论健脾理气方对FD模型大鼠有良好的治疗作用,可改善其胃顺应性及敏感性,改善十二指肠的紧密连接屏障,恢复紧密连接蛋白的表达;其作用机制可能与下调TNF-α/IFN-γ-NF-κB信号通路、上调PGE2-cAMP信号通路有关。