红景天(Rhodiola rosea)系景天科红景天属多年生草本植物,具有安眠镇静、耐缺氧、延缓衰老、抗辐射等药理活性,是著名的一味滋补药材,其强壮机体之功效可媲美人参、刺五加,在我国中医临床上有着悠久的应用历史。此药材含有红景天苷、酪醇等活性成分,具有显著的抗氧化、抗肿瘤的药理活性,近几年国内外有大量有关于其药理作用的报道。但因当前提取技术发展的限制,传统的提取技术在提取效率、提取后活性方面存在一定的不足。超高压提取技术的出现,很好的弥补了这些缺陷,相比传统提取方法,超高压提取具有其独特的优势,如溶剂消耗少、室温下即可提取、提取率高、节能等等。近几年,国内外有大量相关文献报道使用超高压提取法用于中药材有效成分的提取,且实验结果普遍优于常规方法,但尚未见超高压提取技术应用于红景天药材的提取的报道,对超高压提取红景天中红景天苷的最优工艺尚不明确；红景天抗氧化活性研究大多集中于常规提取方法的提取物及活性单体化合物上,尚未有红景天超高压提取物抗氧化活性的报道,且未见关于红景天超高压提取法与其他常规提取法所得提取物之间抗氧化活性相对强弱的比较；此外,很多研究人员已对红景天常规提取法所得提取物及其主要活性成分红景天苷体外抑制肿瘤细胞生长活性做过研究,但未见关于红景天超高压提取法与常规提取法所得提取物对肿瘤细胞体外增殖抑制活性差异比较的相关报道。因此,本文拟采用星点设计-效应面法(CCD-RSM)优选出超高压提取红景天中红景天苷的最佳工艺条件,并在同等提取条件下,与其他常见提取技术就提取得率进行比较,评价各提取方法的优劣；同时对超高压提取和其他常规提取技术的粗提取物就体外抗氧化活性进行比较研究,运用不同的测定方法,建立一系列体外抗氧化体系,来测定这四种提取物及红景天苷对DPPH·、O2-、OH·等自由基的清除能力,及对脂质过氧化的抑制活性,还原能力和总抗氧化能力,综合评价四种提取方法所得红景天粗提取物和红景天苷单体的抗氧化活性强弱大小；此外,选取体外培养的人非小细胞肺癌A549细胞和人鼻咽癌CNE-2细胞作为研究对象,采用MTT法观察红景天超高压提取物和其他三种常规提取法所得提取物对A549细胞和CNE-2细胞的体外增殖抑制作用的差异,初步评价四种提取物细胞抑制活性的强弱。研究目的1、采用CCD-RSM原理优选出超高压提取红景天苷的最佳工艺条件,并就红景天苷得率与其他提取法进行比较分析,初步评价各提取法之优劣。2、综合比较红景天各提取方法所得粗提物的体外抗氧化活性,并就活性差异产生的原因进行初步讨论。3、利用MTT法初步比较四种提取方法所得红景天粗提取对A549和CNE-2细胞体外增殖抑制活性差异。研究方法1、星点设计-效应面积法优化超高压提取红景天中红景天苷①、将红景天药材预处理后,置于密实袋中,按相应料液比加入预设浓度的提取溶剂,放入等静压机,按照预设参数进行操作。将粗提液高速离心,直至变得澄清,取上清液经0.22μm微孔滤膜抽滤。②、通过预实验选定液相色谱仪的色谱条件,配制一定浓度梯度的标准品溶液,绘制标准曲线,在同样条件下测定待测样品溶液并计算平均峰面积,最后根据标准曲线计算红景天苷提取率。③、借助Design-Expert8.0.0软件依据回归方程绘制响应面立体分析图及等高线,考察所拟合的响应面曲线的形状,根据响应面图对任何两个考察因素之间的交互关系进行分析和评价,确定最佳工艺。④、在同等条件下,对超高压提取法和其他三种常规方法进行提取率的比较,综合评定各提取法的优劣。2、各提取法所得提取物及红景天苷体外抗氧化活性的测定①、按预设的实验参数,分别采用超高压提取、回流提取、超声辅助提取及微波提取等四种提取方法对红景天进行提取操作,得各提取方法的粗提液,分别用英文简写UPER、RER、UER、MER表示,作为待测样品溶液；另配制呈梯度浓度的红景天苷标准品溶液,同样作为待测样品溶液；②、分别配制DPPH·反应液、产生O2-的NADH-NBT-PMS溶液体系、产生OH-的Fe3+-EDTA-抗坏血酸-H202溶液体系、以卵黄脂蛋白作底物的脂质过氧化模型反应体系、K3Fe (CN)6-Fe3+还原能力模型反应体系、β-胡萝卜素-亚油酸自氧化体系,按比例加入待测样品溶液,于相应的反应条件下作用后,在特定波长处测定吸光度值,按相应公式计算待测样品对DPPH、O2-、OH·自由基的清除率,对脂质的过氧化抑制能力以及还原能力、总抗氧化能力；③、计算待测样品及阳性对照品在各抗氧化活性测定指标下的IC50值,不同浓度的四种粗提液在某一抗氧化体系中的抗氧化活性采用两因素多水平析因设计方差分析,先做方差齐性检验：方差齐同,采用SNK-q法进行两两之间全面比较；方差不齐,采用Dunnett T3法进行组间两两比较,显著性水准α=0.05,P<0.05为有统计学差异。3、四种红景天粗提物溶液对A549和CNE-2细胞增殖抑制作用的比较①、按预设的实验参数,分别采用超高压提取、回流提取、超声辅助提取及微波提取等四种提取方法对红景天进行提取操作,得各提取方法的粗提液,分别以英文简写UPER、RER、UER、MER表示,作为待测样品溶液；以5-氟尿嘧啶(5-Fu)作阳性对照药物；②、MTT法绘制A549和CNE-2细胞的生长曲线,确定两肿瘤细胞系最佳生长状态时间点为培养后48h；③、利用MTT法进一步测定加药后72h各处理组的细胞增殖抑制率,然后计算四种待测样品及5-Fu对两细胞系增殖抑制的IC50值。不同浓度的四种粗提液处理A549和CNE-2细胞后的体外增殖抑制率采用两因素多水平析因设计方差分析,先做方差齐性检验：方差齐同,采用SNK-q法进行两两之间全面比较；方差不齐,采用Dunnett T3法进行组间两两比较,显著性水准α=0.05,P<0.05为有统计学差异。研究结果1、星点设计-效应面积法优化超高压提取红景天中红景天苷超高压提取红景天中红景天苷的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度77.3%、液固比为29.5、提取压力为255.5Mpa,此时红景天中红景天苷提取率的最大估计值Y=9.46mg·g-1;超高压提取法提取红景天中红景天苷的提取率(9.29mg·g-1)、要高于其他三种提取方法(回流:7.10mg·g-1;超声:7.72mg·g-1;微波:8.48mg·g-1),且提取所用时间(2min)明显短于回流提取法(2h)和超声提取法(30min)。2、各提取方法所得提取物及红景天苷单体的体外抗氧化活性测定本实验共模拟了六种体外自由基发生体系,包括DPPH·、NBT-NADH-PMS、 Fe3+-EDTA-抗坏血酸-H202、卵黄脂质过氧化模型反应体系、还原铁氰化钾以及p-胡萝卜素—亚油酸自氧化体系,分别测定了四种提取法所得粗提物溶液UPER、UER、MER、RER对DPPH·、O2-·、OH·三种自由基的清除能力,以及它们对脂质过氧化的抑制能力、还原能力、总抗氧化活性,以此来比较研究不同提取技术提取得到的红景天粗提物的体外抗氧化活性。综合六种体外抗氧化活性评价方法的实验结果：①、除O2-·清除活性四种粗提物无显著差异外,UPER对DPPH·、OH·清除活性以及抑制脂质过氧化能力、还原能力、总抗氧化活性五个测定指标均大于MER、RER; UPER在OH·清除活性、抑制脂质过氧化能力、还原能力三个指标方面优于UER,在DPPH·、总抗氧化活性两个指标方面与UER相当。②、UER在DPPH·清除活性、总抗氧化活性两个测定指标上均要大于MER,而在OH-、O2-·清除活性以及抑制脂质过氧化能力、还原能力四个指标方面与MER大小相当；除02-·清除活性外,在其它五个体外抗氧化活性测定指标上UER均要强于RER。③、MER在DPPH·、 OH·清除活性以及抑制脂质过氧化能力、还原能力四个指标上表现得优于RER,而在02-·清除活性、总抗氧化活性两个指标方面MER、RER活性大小相当。因此由以上比较可以对四种提取方法所得红景天粗提物体外抗氧化活性进行总体评价,得出以下初步结论：UPER>UER>MER>RER。3、四种红景天粗提物溶液对A549和CNE-2细胞增殖抑制作用的比较MTT法检测结果表明：①、四种粗提物溶液UPER、UER、MER、RER对A549细胞增殖生长的半数抑制浓度IC50依次为2.088mg/ml、2.237mg/ml、1.974mg/ml、2.931mg/ml,故体外抗肿瘤活性大小顺序依次为：MER>UPER> UER>RER。统计学结果同样证明,UPER、UER、MER两两之间无显著性差异(P<0.05),而UPER、UER、MER三者之一与RER之间均有显著性差异(P>0.05)。故UPER、UER、MER对A549细胞增殖抑制活性相当,且均要强于RER。②UPER、UER、MER、RER对CNE-2细胞增殖生长的半数抑制浓度IC50依次为2.239mg/ml、2.385mg/ml、2.277mg/ml、2.782mg/ml。统计学结果表明,UPER. MER两者间的体外增殖抑制活性无显著性差异(P<0.05),UER与MER间无显著性差异(P<0.05),UPER与UER间有显著性差异(P>0.05),而UPER、UER、MER三者之一与RER之间均有显著性差异(P>0.05),故UPER、 UER、MER三者对CNE-2细胞株增殖抑制活性相当,而RER的抑制活性要低于前三者。研究结论(1)、从红景天中提取红景天苷,就提取得率而言,超高压提取法要优于回流提取、微波提取法和超声辅助提取法。(2)、与其他三者常规提取法相比,超高压提取法提取得到的红景天粗提物的抗氧化活性最高,这可能与此方法提取时间短、对抗氧化活性成分提取能力强、提取过程活性成分降解破坏少等因素有关。(3)、在实验设定的浓度范围内,UPER、UER、MER对人非小细胞肺癌A549和人鼻咽癌细胞CNE-2的生长增殖均具有抑制作用,抑制活性大小相当；RER也表现一定的增殖抑制活性,但活性要弱于前三种提取法所得粗提物。