病理性瘢痕是人类皮肤创伤后后组织修复过程中的必然产物，其机制尚不完全清楚，一般认为皮肤的迁延愈合，修复细胞中成纤维细胞的大量增殖与凋亡抑制，细胞外基质中胶原合成与降解失衡所引起。因此，加速皮肤创伤愈合，抑制成纤维细胞的过度增殖和促进细胞外基质中大量胶原的降解是治疗病理性瘢痕的基本原则。肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor，HGF）是一种多功能的生理性细胞因子，能加速表皮和内皮细胞的迁移运动和分裂增殖；并能抑制转化生长因子-β1（Transforming growth factorβ1，TGFβ1）的活性，促进多种基质金属蛋白酶产生。为此，我们开展了HGF基因治疗和预防病理性瘢痕的动物实验及其相关机理的研究。目的是评价HGF基因治疗和预防病理性瘢痕的疗效，为HGF防治病理性瘢痕提供实验依据；并探讨其相关机理，为HGF促进创伤愈合、治疗病理性瘢痕提供理论基础。我们首先制作兔耳腹侧增生性瘢痕模型，局部注射携带人HGF基因的质粒pUDKH后，通过大体观察、肥大指数测量、组织病理学观察、天狼猩红染色、细胞凋亡情况及α-SMA的表达几方面，评价HGF在治疗病理性瘢痕方面的疗效。大体观察可见局部注射pUDKH 15d后，皮肤创口瘢痕组织变平、颜色变暗，而对照组创口依然保持增生性瘢痕组织特性，红肿且高出周边正常皮肤。pUDKH组的肥大指数最小（1.61±0.25），而两对照组分别为2.29±0.2和2.30±0.11。组织病理学观察可见pUDKH组表皮分化较好，接近正常皮肤厚度，细胞排列成典型复层鳞状上皮并伴有角化形成；对照组表皮细胞分化相对差，细胞层相对较厚。而且对照组真皮层纤维组织明显较pUDKH组厚，且纤维束粗大，排列紊乱。同时对组织进行天狼猩红染色，偏振光显微镜下观察到对照组创口存在较丰富而粗大的Ⅰ型胶原。这就表明HGF有减少创口组织中胶原形成的作用。羟脯氨酸在胶原蛋白中含量恒定，可直接反映皮肤组织中胶原蛋白含量。通过对皮肤中羟脯氨酸含量的检测，显示pUDKH组单位皮肤组织内的羟脯氨酸含量较对照组明显减少（pUDKH组为1.08±0.11μg／ml皮肤湿重，对照组分别为1.50±0.27和1.47±0.17μg／ml皮肤湿重）。运用TUNEL检测了pUDKH组和对照组兔耳瘢痕组织中细胞凋亡情况，结果显示pUDKH组明显比对照组细胞凋亡数目多。这就说明HGF可能通过促进肌成纤维细胞凋亡的途径来达到治疗病理性瘢痕的目的。同时免疫组化染色结果提示，在pUDKH组随着瘢痕的成熟α-SMA的表达逐渐下降，说明肌成纤维细胞在不断退缩，符合生理性反应。但是在对照组瘢痕组织中α-SMA的表达水平依然较高，大量肌成纤维细胞依然在增生性瘢痕组织存在。在上述实验的基础上，我们对HGF促进瘢痕组织内成纤维细胞的凋亡及抑制其α-SMA的表达的细胞和分子机理进行了探索研究。首先，我们分离培养正常皮肤（Normal skin fibroblast，NFB）与增生性瘢痕（Hypertrophic scar fibroblasts，HFB）来源的原代成纤维细胞，模拟体内基因感染方式，运用携带人HGF基因的腺病毒感染细胞，从细胞增殖、超微结构和细胞内Ca²⁺变化及IP3R的mRNA表达情况等方面，来观察HGF对这两种细胞的作用是否有所不同。我们首先检测了腺病毒对这两者的感染效率和HGF及其受体的表达，结果表明两种细胞之间没有明显区别。于是我们用MOI为100的Ad-HGF感染细胞后，MTT检测细胞增殖情况，发现HGF可以抑制HFB的增殖，对NFB则既不抑制也不促进其增殖。为了阐明其中可能的机制，我们又进一步观察了Ad-HGF感染细胞后，其超微结构和细胞内Ca²⁺的变化。透射电镜下可以看到在感染Ad-HGF前HFB胞浆内粗面内质网、游离核糖体和线粒体较NFB的多，上述细胞器的增多可视为成纤维细胞合成分泌胶原功能增强的表现。这也意味着HFB胶原合成能力要比NFB强。而感染Ad-HGF后72h可观察到HFB出现凋亡的现象：细胞核固缩，染色质凝集，紧贴于核膜周边；细胞表面有许多短小突起，可见微绒毛和胞浆皱褶；丰富的粗面内质网逐渐扩张、聚集，膜表面脱颗粒；线粒体高度扩张，数量减少，胞浆内出现空泡。而Ad-HGF感染前后NFB变化则不明显。同时，激光扫描共聚焦显微镜下观察两种细胞在感染Ad-HGF后胞浆内Ca²⁺的变化，发现HFB随着时间的推移，细胞内荧光强度逐渐增强，这表明游离形式的Ca²⁺逐渐增多。NFB感染前后细胞内荧光则没有明显变化。而引发细胞内钙释放的机理，研究的最透彻的是1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）作为第二信使诱导胞内Ca²⁺浓度升高。RT-PCR的结果表明感染Ad-HGF后HFB和NFB细胞中1，4，5-三磷酸肌醇受体（IP3R）mRNA的表达上调，但HFB中IP3R上调的幅度明显较NFB大。由此推测，HGF引起HFB凋亡可能是通过介导Ca²⁺信号途径。其次，为了阐明肌成纤维细胞中α-SMA和原癌基因c-MVb的关系，我们构建了携带c-Myb基因的质粒，转染小鼠成纤维细胞系NIH3T3细胞，经G418筛选后得到稳定表达c-Myb的单克隆细胞株。此时，我们运用免疫荧光和Western blot的方法检测到α-SMA的表达，证明了c-Myb的过表达可使NIH3T3成纤维细胞发生转化，从而表达α-SMA。而感染Ad-HGF后，NIH3T3细胞中α-SMA的表达下降，同时伴随着TGF-β1和c-Myb的下降。我们进一步在瘢痕来源成纤维细胞中证明了HGF可以抑制TGF-β1的分泌，进而影响c-Myb的表达，最终使成纤维细胞中α-SMA、Ⅰ型胶原的表达下调。将携带人HGF的质粒载体局部注射到大鼠皮肤创伤周围，观察其对创伤愈合的影响。结果发现，pUDKH可以介导HGF促进肉芽组织内毛细血管生长，并加速再上皮化过程，对皮肤创伤愈合有明显的促进作用。体外研究进一步证实，HGF通过促进尿激酶型纤溶酶原激活剂的表达，为表皮细胞的增殖和迁移提供有利条件。通过以上的结果，我们可以得出：①HGF基因治疗病理性瘢痕具有明显的效果：HGF可以减少兔耳瘢痕内胶原组织、抑制肌成纤维细胞α-SMA的表达、促进肌成纤维细胞的凋亡；②HGF通过钙离子信号通路诱导瘢痕组织来源的成纤维细胞的凋亡；③HGF可能通过抑制原癌基因c-Myb的表达，影响TGF-β1的分泌，进而下调瘢痕组织内成纤维细胞α-SMA和Ⅰ型胶原的产生；④大鼠皮肤创伤部位局部基因注射HGF后，再上皮化过程加速；HGF可以通过促进尿激酶型纤溶酶原激活剂的分泌加速表皮细胞的增殖迁移和肉芽肿内毛细血管的新生。