大白菜起源于中国,是我国及日本、韩国、朝鲜等东亚国家普遍栽培的大宗蔬菜作物。现代的大白菜品种遗传改良及功能基因组研究,要求建立稳定的遗传转化体系。前人的研究表明,传统的基于农杆菌Ti质粒的叶盘法遗传转化在大白菜上应用不够理想,构建高效的大白菜遗传转化体系势在必行。本项研究将大白菜游离小孢子培养技术与细胞穿透肽的穿膜作用相结合,以构建构建新的大白菜遗传转化体系,主要研究成果如下：1.为建立高效的遗传转化后的小孢子再生植株体系,从筛选小孢子预处理方法、改进培养基配方、改善培养条件等环节入手,优化了大白菜游离小孢子培养技术,建立了高出胚率和高再生率的大白菜游离小孢子培养技术体系。2.选取质粒载体pBI121(含有GUS报告基因)和pBI221-GFP(含有GFP报告基因),用热激法将其转入大肠杆菌。pBI121全长14758bp,4951bp处有HindⅢ酶切位点,7983bp处有EcoRⅠ的酶切位点,采用这两种酶对其进行双酶切反应,得到了含有GUS基因的完整表达片段。pBI221-GFP全长4530bp,在18bp处用PstⅠ进行单酶切反应使其线性化,得到了GFP的完整表达片段。根据两个载体中目的片段的序列,分别对其设计了两对引物(产物长度分别为703bpbp,509bp和523bp,300bp),在不同的区域进行PCR扩增反应。通过PCR扩增反应、酶切反应来鉴定是否转化成功。实验结果显示,在部分转化处理材料中,用PCR扩增出了预期大小的片段,酶切片段也与预期的片段大小一致。利用琼脂糖凝胶回收酶切的目的片段,回收片段条带清晰锐利,无降解。3.利用优化的大白菜游离小孢子培养体系,结合细胞穿透肽的穿膜作用进行转染实验。在正式的转染实验之前,我们做了转染剂对小孢子培养的影响试验,结果显示,添加转染剂Lipofectamine TM 2000后,小孢子胚胎发生受到了抑制,当其浓度达到4ug/mL时,小孢子胚胎发生完全受到抑制,因此,转染剂不适合应用于本研究的转染实验。将CPPs与目的基因片段DNA按照4：1的比例相结合,通过DNasel保护分析实验鉴定两者是否结合。由于CPPs与目的基因片段DNA之间通过形成氢键而免于被消化,所以实验结果得到的片段稍微大于目的片段DNA。添加CPPscargos复合物后,小孢子胚胎发生率在1.87-2.01胚每蕾之间,对照在2.10-2.33胚每蕾之间,可见CPPscargos复合物对小孢子胚胎发生的影响很小。添加复合物后首先在33℃培养箱中进行24h热激处理,有利于小孢子胚胎发生；培养第3天更换和添加新的培养液,也有利于小孢子胚胎的发生。获得了236株GFP转化的小孢子再生植株和1088株GUS转化的小孢子再生植株。4.为筛选阳性转基因植株,采用植物新型DNA提取试剂盒提取再生植株的基因组DNA,经琼脂糖凝胶电泳检测,其条带清晰锐利,无降解。以质粒DNA为阳性对照模板,非转化大白菜基因组DNA为阴性对照模板,对提取的转化植株基因组DNA进行PCR扩增,结果在1088株GUS转化再生植株中,两对特异性引物分别有207和163株(两者重复的共有151株,总阳性植株共有219株)扩增得到了预期大小为703bp和509bp的片段,PCR阳性率分别为19.03%和14.98%,阳性对照扩增得到同样大小的片段,而阴性对照则未扩增出条带。在经抗生素筛选得到的236株GFP转化再生植株中,两对特异性引物分别有121和115株(两者重复的共有99株,总阳性植株共有137株)扩增得到了预期大小为523和300 bp的目的片段,PCR阳性率分别为51.27%和48.73%,阳性对照扩增得到了同样大小的片段,而阴性对照则未扩增出条带。5.为了进一步鉴定筛选PCR扩增得到的阳性植株,进行了GUS组织化学染色实验。在151株PCR阳性植株中分别有121株叶片上出现蓝色,转化频率约为11.1%,对照处理未有蓝色出现,证明多数插入大白菜基因组的GUS基因得到了表达。对GFP阳性植株,采用Fluor Cam便携式ChI/GFP荧光仪进行检测,在蓝色激发光的照射下,99株PCR阳性转化植株中分别有80株叶片出现了绿色荧光,转化频率约为33.9%,而对照中未出现绿色荧光,证明了多数插入大白菜基因组的GFP基因也得到了表达。6.选用罗氏地高辛标记试剂盒Ⅱ对部分转基因植株进行Southern Blot检测,在DNA水平上分析了外源基因插入大白菜基因组中的情况。为检测方便,分别选取10株组织化学染色的阳性植株和10株GFP荧光观察的阳性植株进行Southern Blot试验。以质粒DNA为模板,进行PCR扩增,扩增产物用DNA产物纯化试剂盒回收,用于制作探针。标记好的探针分别稀释20,50,100,200倍,与对照DNA进行比对,计算探针的量,以便后来的杂交试验。针对两种质粒载体,分别用限制性内切酶HindⅢ和SphⅠ,对大白菜基因组DNA进行酶切反应,经琼脂糖凝胶电泳检测,两者DNA均成弥散状态,符合实验要求。随后对酶切后的DNA进行电泳、转膜、杂交、显色,结果显示,两种阳性植株都出现了杂交信号,有单拷贝,也有多拷贝,这证实了一部分转化植株外源基因以单拷贝形式插入基因组中,一部分转化植株外源基因以多拷贝形式插入。非转化植株没有杂交信号出现,因此,证明外源基因已成功整合到大白菜基因组中。7.对得到的阳性转基因植株利用流式细胞仪进行了倍性鉴定,GUS阳性植株中单倍体、双单倍体和嵌合体比率分别为23.16%、69.49%和7.34%；GFP阳性植株中单倍体、双单倍体和嵌合体比率分别为26.53%、66.33%和7.14%。本研究首次建立的细胞穿透肽介导的大白菜小孢子遗传转化体系操作方法简便,可缩短育种周期,且转化频率(11.1%,33.9%)远高于根癌农杆菌介导的遗传转化方法的转化频率(<3%)。将为大白菜遗传转化提供基础的研究平台。