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目的:适当程度的炎性反应对骨折愈合具有重要作用,脾是机体内最大的免疫器官,包含大量免疫细胞及炎性因子,这些免疫细胞及炎性因子与机体损伤修复密切相关。关于脾切除对骨折有何影响,目前的报道很少,本课题组的前期临床研究发现复合外伤骨折合并脾破裂而行脾切除的患者中,骨折愈合常减慢,但临床病例的干扰因素比较多,病情复杂,为了去除掉这些干扰,本研究拟创建股骨骨折合并脾切除的大鼠模型,探讨脾脏切除后机体免疫炎性反应的改变以及其对骨折愈合的影响。MicroRNA(miRNA)是一类短链非编码RNA,能和其靶基因mRNA3’端的非翻译区进行特异的结合,对靶蛋白的翻译起始起抑制作用,或者直接对靶基因进行降解,在转录后水平调节靶蛋白的表达,其在机体的病理、生理以及发育过程中扮演重要角色。本研究拟通过miRNA芯片来筛选大鼠骨折合并脾切除模型中的差异表达的miRNAs,并对其在调控免疫炎性反应和骨折愈合中的作用和机制进行研究。研究方法:1.脾脏切除对免疫炎性反应及骨折愈合的影响:(1)随机将SPF级SD大鼠(体重250±20g)分为两组,股骨骨折合并假脾切除组(F组),55只;股骨骨折合并脾切除组(F+S组),60只。进行大鼠骨折模型制作,在股骨中段做横行骨折后,选取适合直径的克氏针进行骨髓腔内牢固固定。实验组骨折同时切除脾脏;对照组制作骨折及开腹方式同实验组,仅游离脾脏,不切断脾门血管,也不切除脾脏。在术后第0、3、15、30d四个时间点取材,取材样本为各组大鼠外周血及骨折端的血肿骨痂组织,进行分子生物学相关的指标检测以及组织病理学的检查。(2)免疫炎性指标检测:ELISA法和Real-time PCR检测各组血清、骨折端血肿组织中IL-1β、IL-6、TNF-α及其mRNA的表达水平;骨折血肿组织行F4/80/CD11b免疫荧光双染,以观察巨噬细胞的聚集情况。(3)成骨标.志物检测及组织学检查:试剂盒法检测各组血清中ALP活性;ELISA法检测血清中osteocalcin(骨钙素)的水平;Real-time PCR检测骨折端血肿组织中ALP、osteocalcin mRNA表达水平;Western blot检测骨折组织中OPG、RANKL、Col1a1、Col2a1的表达。HE染色观察各组骨痂的生长情况及其组织形态;2.miRNA芯片筛选脾切除骨折组差异表达的miRNAs:股骨骨折合并假脾切除组、股骨骨折合并脾切除组SD大鼠各10只,取造模术后第3天两组大鼠(每组取3只)的外周血进行芯片筛查(miRCURYTM LNAArrayExiqon),对差异表达的miRNAs行Real-time PCR验证以及生物信息学分析。3.miRNA对脾切除骨折愈合的作用及机制研究:(1)细胞试验:①明确脾切除血清对BMSCs细胞向成骨分化的影响。BMSCs成骨诱导分化过程中加入骨折合并假脾切除大鼠血清、骨折合并脾切除大鼠血清,做ALP活性检测、ALP染色及茜素红染色以比较各组的成骨分化情况。②明确miR-30d在脾切除血清影响BMSCs细胞成骨分化中的作用。分别向BMSCs细胞中转染antagomiR-30d及antagomiRNC,并加入脾切除血清培养,转染后行Real-timePCR验证转染效果,行ALP染色、茜素红染色、ALP活性及Western blot检测以比较各组的成骨分化情况。(2)动物实验:分为四组:A组:股骨骨折合并假脾切除组,B组:股骨骨折合并脾切除组,C组:股骨骨折并脾切除+antagomiRNC组,D组:股骨骨折并脾切+antagomiR-30d组,每组分别有SD大鼠25只。C组和D组在B组基础上分别给予大鼠尾静脉注射antagomiRNC或antagomiR-30d,1.5mg/kg,每周2次,至实验结束。骨折术后第0、3、15、30d四个时间点取外周血及骨折端的血肿骨痂组织进行检测。①Real-time PCR检测miR-30d及其靶基因Fox03a mRNA在每组各时间点的表达;Western blot检测骨折端血肿组织中靶蛋白Fox03a的的表达。②免疫炎性指标检测:ELISA法检测各组血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平。③成骨标志物检测及组织学检查:检测各组血清中ALP活性和osteocalcin蛋白水平;Real-time PCR检测骨折端血肿组织中ALP、osteocalcin mRNA表达水平;HE染色观察各组骨痂生长情况及其组织形态;免疫组化染色分析OPG、RANKL的表达。结果:1.免疫荧光双染发现术后3d骨折组织中F4/80/CD11b双阳细胞开始显著增加,30d时下降,但相对于单纯骨折组,F4/80/CD11b双阳细胞在脾切除组显著下降(P<0.01),表明脾切除后其骨折部位的巨噬细胞聚集较单纯骨折组下降,证明脾切除抑制大鼠免疫炎性反应。2.ELISA法和Real-time PCR发现术后3d血清及骨折端血肿组织中炎性因子TNF-α、IL-1 β、IL-6及其mRNA的表达在单纯骨折组显著增加,而脾切除后表达明显减少(P<0.01),表明脾脏切除抑制骨折愈合所必须的炎症反应。3.HE染色发现术后15d在骨折部位可见成纤维细胞和软骨细胞的分化,并形成纤维性骨痂,而脾切除后该现象被显著抑制。4.Western blot发现骨折后OPG表达开始增加,到骨折手术后15d达到高峰,持续到骨折术后30d;RANKL在骨折术后3d达到高峰,持续到骨折术后30d。相比于单纯骨折组,骨折合并脾切除组两指标的表达显著下降(P<0.01),说明脾切除抑制骨生成;骨折术后3d开始Col1a1和Col2a1的蛋白表达即开始显著升高,到骨折后15d两指标的表达达到峰值,持续至骨折后30d,而脾切除后两指标在各时间点的表达相对于单纯骨折组均显著降低(P<0.01)。说明脾切除抑制股骨骨折愈合中骨基质的形成。5.术后3d开始ALP的活性及osteocalcin的表达显著升高,持续至30d,而脾切除显著抑制两者的表达(P<0.01),说明脾切除抑制成骨分化。6.应用microRNA芯片筛选出两组样品间的差异表达microRNA共 5 种(Fold change>1.5,P-value<0.05),其中上调 2 种:miR-30d-5p,miR-374-5p,下调 3 种:miR-27a-3p,miR-183-5p,miR-196b-5p。经过Real-time PCR验证及生物信息学分析,表明miR-30d-5p处于该损伤调控基因网络的中心,确定为下一步研究的对象。7.骨折合并脾切除大鼠的血清显著抑制BMSCs细胞成骨分化,ALP活性、ALP染色及茜素红染色的钙化结节数量均低于骨折合并假脾切除血清组。8.在BMSCs细胞中转染antagomiR-30d后,可对抗脾切除血清引起的miR-30d升高,提高Fox03a和Runx2蛋白的表达,促进成骨分化,从而可缓解脾切除血清对BMSCs细胞成骨分化的抑制作用。9.大鼠尾静脉注射miR-30d抑制剂后,第3天时体内miR-30d已下调,其靶基因Fox03a表达上调,而注射空白对照无此作用,成骨相关指标 ALP、osteocalcin、OPG、RANKL 及炎性因子 IL-1β、IL-6、TNF-α的表达得到增加,HE染色和免疫组化染色发现骨痂中软骨细胞数量增多,骨痂质量提高,骨痂中OPG、RANKL蛋白表达增多。结论:脾脏切除显著降低大鼠股骨骨折愈合部位巨噬细胞数量,抑制大鼠免疫炎性功能。脾切除显著减少大鼠股骨骨折愈合过程中炎性细胞因子释放,抑制骨折愈合所必须的炎症反应。脾切除抑制骨折愈合过程中骨生成标志物的表达,抑制骨分化及骨基质形成,延缓大鼠骨折愈合。miRNA参与脾切除后免疫炎性功能的改变并影响骨折的愈合,miR-30d处于该调控网络的中心位置,miR-30d及其靶基因Fox03a在免疫系统介导的骨折愈合中具有调控作用。