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落新妇为虎耳草科Saxifragaceae植物落新妇Astilbe chinese(Maxim.)Franch.etSav.的干燥根茎，具有祛风、清热、止咳等功效，民间主要用于风热感冒、头身疼痛、发热咳嗽。浙江富阳民间用落新妇(民间称为“黑芨”)治疗各类癌症，是各种已知抗癌中草药中作用较好的一种。体内外药理学实验也证实其确实具有抗肿瘤作用。3β—羟基齐墩果—12—烯—27—羧酸(3β—hydroxyolean—12—en—27—oic acid，ATA)系以体外抗肿瘤活性为导向，从落新妇中定向追踪筛选分离得到的具有显著抗肿瘤活性的三萜类化合物。ATA与齐墩果酸结构非常相似，仅存在C—14和C—17位上连接的甲基和羧基位置互换的区别。这类羧基位于C—14位上的齐墩果烷型三萜在自然界中较少见。本文采用细胞培养技术和多种细胞凋亡检测方法，检测ATA体外对人结直肠癌COLO205细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用，探讨其诱导COLO205细胞凋亡的机理，并研究ATA对正常小鼠和荷瘤小鼠细胞免疫和体液免疫功能的影响，评价其对小鼠免疫功能的促进作用。
1.ATA体外抗肿瘤作用机理的研究
MTT法测定结果表明，ATA对体外培养的COLO205细胞增殖有显著的抑制作用，且呈浓度依赖性。ATA作用COLO205细胞48h的最高抑制率达91.4±1.11％，IC50值为7.31±0.24μg/ml。用台盼蓝拒染法测定ATA对COLO205细胞生长的影响，发现ATA各浓度在0到96h间对COLO205细胞增殖均有抑制作用，并呈时间依赖性。
考马斯亮蓝法测定经不同浓度ATA处理48h的COLO205细胞中总蛋白含量的结果显示ATA可显著降低COLO205细胞内蛋白质含量，并呈现浓度依赖性。
吖啶橙荧光染色形态学观察不同浓度ATA处理COLO205细胞48h对其细胞形态的影响。发现对照组细胞核着色均匀，ATA各浓度处理组细胞皱缩、核浓染甚至可见浓染的碎片。电镜观察ATA处理细胞出现典型的凋亡超微结构变化，表现为细胞体积缩小，胞膜完整，表面微绒毛减少或消失；胞浆浓缩，胞浆内可见空泡增多；细胞核染色体发生边集固缩，在核膜周边聚集形成高电子密度的质块，并出现凋亡小体。ATA15μg/ml可诱导COLO205细胞DNA降解，在琼脂糖凝胶电泳上呈特征性“梯状”条带。
流式细胞仪检测分析结果表明，COLO205细胞经ATA3.75、7.5、15μg/ml处理48h后，其G0/G1期细胞百分比随着ATA浓度的增加而上升，而S期和G2/M期细胞百分比则显著下降。
COLO205细胞经不同浓度ATA作用48h后，用SABC法免疫组化检测其Bcl—2和Bax蛋白表达，计算机半定量分析结果显示，与对照组相比，ATA处理组细胞Bcl—2表达阳性率降低，Bax表达阳性率升高；Rh123染色后，流式细胞仪检测结果显示，ATA能显著降低COLO205细胞线粒体跨膜电位(Δψm)，并呈浓度依赖性关系(P＜0.05)。MTT法检测结果显示caspase—3抑制剂DEVD—CHO可显著提高经ATA(6.33、8.44、11.25、15、20μg/ml)处理48h后COLO205细胞的存活率。
ATA对体外培养的COLO205细胞有显著的增殖抑制作用，能使COLO205细胞阻滞于G0/G1期，并可下调细胞Bcl—2蛋白表达，上调Bax蛋白表达，降低线粒体膜电位，激活caspase—3，从而诱导COLO205细胞凋亡。
2.ATA对小鼠免疫功能的影响
ATA微乳口服给药对正常小鼠血清凝集素的影响结果显示，ATA微乳灌胃给药60 mg/Kg剂量时可显著提高小鼠血清抗体积数(P＜0.05)，说明ATA微乳可显著促进正常小鼠抗体的生成。二硝基氟苯(DNFB)所致小鼠耳廓皮肤迟发型超敏反应(DTH)检测结果显示，与空白对照组比较，ATA微乳灌胃给药40 mg/Kg剂量时可极显著增加小鼠的耳肿胀度(P＜0.01)，说明ATA微乳可显著增强正常小鼠的细胞免疫功能。
采用MTT法检测了ATA微乳灌胃给药对S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响，结果表明：给予ATA微乳后荷瘤小鼠T、B淋巴细胞的增殖能力得以显著或极显著地提高(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)，而腹腔注射CTX可使S180荷瘤小鼠体内T、B淋巴细胞增殖能力极显著地降低(P＜0.01)。从剂量.效应关系看，ATA微乳以20 mg/Kg和40 mg/Kg作用较佳。MTT法检测ATA微乳口服给药后S180荷瘤小鼠NK细胞活性和脾细胞产生IL—2水平的结果显示，ATA微乳3个剂量均可极显著提高荷瘤小鼠NK细胞的活性(P＜0.01，P＜0.001)，20mg/Kg和40mg/Kg剂量可同时极显著诱导荷瘤小鼠脾淋巴细胞分泌IL—2(P＜0.01)，而环磷酰胺对照组小鼠NK细胞的活性和脾细胞分泌IL—2的能力均极显著低于对照组(P＜0.01，P＜0.001)。
ATA微乳在体内能显著地提高正常小鼠血清凝集素和增强迟发性超敏反应，也能显著提高荷瘤小鼠的T、B淋巴细胞增殖能力、NK细胞活性以及促进荷瘤小鼠脾细胞产生IL—2的能力，说明ATA微乳可通过增强小鼠体液免疫和细胞免疫功能从而发挥抗肿瘤作用。