病原获得抗性是植物抗病毒基因工程的一个重要策略,即将病毒自身的基因导入植物后,可使该植物对同种及亲缘关系较近的病毒产生抗性,在该策略中应用最早的基因是来自病毒的外壳蛋白基因。大量的研究表明,导入植物的基因转录物可与入侵的病毒RNA之间相互作用,干扰病毒的侵染或复制,这种抗性主要是基于转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)作用。苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)在苹果和梨树上发生极其普遍的一种+ssRNA病毒,在果树上多表现为潜伏侵染,但可导致树势的降低和影响果品质量。同时,该病毒可通过汁液摩擦接种传染至多种草本植物,接种草本寄主植物是研究该病毒生物学特性的常用途径之一。本研究基于dsRNA在RNA沉默中的诱导作用,构建ASGV外壳蛋白基因片段的转录后可形成发夹状RNA(hpRNA)的载体,通过农杆菌介导转化该病毒的草本寄主植物本氏烟,以期为进一步研究hpRNA诱导对同源病毒和异源病毒的抗性及其RNAi特性奠定基础。(1)根据ASGV的CP基因序列特点,设计合成了可扩增该基因近3’端和5’端大小分别为209bp和392bp的两对引物,并在各引物5’端引入两个酶切位点。以本实验室保存的一个ASGV分离物CP基因克隆的质粒为模板,用所合成两对引物分别扩增获得长度为392bp和209bp的特异片段。通过回收、连接、转化E.coli DH10B和酶切鉴定,对所获扩增片段进行了克隆。(2)采用所设计酶切位点对应的两对限制性内切酶对含有392bp克隆片段的质粒分别进行双酶切,回收目标片段后与相同双酶切的表达载体pASDS714进行连接和转化大肠杆菌,获得含有392bp片段的正向和反向插入片段的重组质粒pASDS714-392(+)和pASDS714-392(-)然后对获得的pASDS714-392(+)采用另一对酶进行双酶切后与同对酶双酶切获得的392bp片段连接,获得在内含子两端分别含有正向插入和反向插入片段的可表达hpRNA的重组质粒pASDS714-392(hp)。(3)采用同样的方法,构建了ASGV CP基因3’端大小为209bp片段的正向插入和反向插入的重组质粒pASDS714-209(+)和pASDS714-209(-)。(4)将以上所获含392bp反向插入片段和可表达392bp片段的hpRNA的重组质粒分别转化根癌农杆菌EHA105后,采用农杆菌侵染法转化本氏烟(Nicotianabenthamiana)叶盘,经共培养和抗性筛选,获得pASDS714-392(-)和pASDS714-392(hp)转化的抗性芽系各24和32株。采用CTAB法从获得的各抗性芽系的离体培养植株提取总DNA,利用扩增该片段的特异引物对其6个和13个芽系进行PCR鉴定,前者有3株检测为阳性,后者13株检测结果均为阳性。