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产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是导致猪场仔猪发生腹泻的一种重要致泻性致病菌,感染后引起初生到保育期间仔猪腹泻和黄白痢,也是目前规模化猪场难以根除的一种肠道致病菌。发病仔猪主要临床表现为腹泻、脱水、消瘦、拉黄痢或白痢,严重可引起死亡,且具有传染性,是一种十分重要的猪大肠杆菌病。经临床调查发现仔猪黄白痢是发生频率最高的猪大肠杆菌病,其病原ETEC存在普遍高耐药性和高致病性,严重危害养猪业健康发展。本研究通过调查苏北地区规模化猪场ETEC流行情况,分析其血清型、耐药性和致病力等生物学特性,研制具有广谱免疫保护效果的O抗原灭活疫苗,对苏北地区规模化猪场ETEC进行监测及有效防控。1苏北地区猪产肠毒素大肠杆菌分离鉴定从苏北地区21个规模化猪场采集初生到30日龄仔猪的新鲜粪样、直肠棉拭子及小肠样共562份,经平板划线、菌落形态观察,其中528份病料分离出792株疑似大肠杆菌。通过显微形态观察、PCR鉴定菌株特异性致病型、16S rRNA测序鉴定确定为ETEC菌株有141株,占总病料数的25.1%。使用PCR方法结合37种标准O抗原血清进行玻板凝集试验鉴定141株ETEC菌株的血清型;用14种常见抗生素标准药敏纸片,分析分离菌株耐药性和敏感性,并做整体耐药性分析;小鼠攻毒试验鉴定分离菌株致病力;研制灭活苗,并进行小鼠免疫保护试验分析灭活疫苗免疫保护效果。使用常规血清型鉴定玻板凝集试验结合PCR分子生物学鉴定方法,使用7种多价O抗原血清和37种单因子ETEC常见O抗原血清,对分离出的141株ETEC菌株进行血清型鉴定。试验结果表明,所分离的141株ETEC菌株具有较多的O抗原血清型,定型85株,占ETEC菌株总数的60.3%,1株自凝,2株出现多价凝集而单价不凝;其中08、0101和0128为优势血清型,分别占定型菌株数的29.4%、20%和占11.8%,占ETEC菌株总数的17.7%、12.1%、7.1%;三个优势血清型占定型菌株数的61.2%,占ETEC菌株总数的36.9%。其他血清型包括09、03、020、0148、0149、0111、0138、0139、0141、025、0115、0119、0153、045、089 等 15 种。2苏北地区猪产肠毒素大肠杆菌生物学特性分析对所分离141株ETEC菌株肠毒素和毒力岛等相关毒力因子进行鉴定,试验结果表明所有ETEC分离菌株均含有ST基因,有25%的菌株含有LT基因,有25%的菌株含有Ler基因,含有Irp2、fyuA、eaeA基因的菌株占10%。药敏试验对141株ETEC进行14种药敏片的耐药性分析,得出所分离的ETEC对新霉素、红霉素、四环素、庆大霉素、强力霉素、阿莫西林、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑高度耐药,分别为 95%(134/141)、100%(141/141)、99.3%(140/141)、80.9%(114/141)、100%(141/141)、92%(130/141)、96.5%(136/141),耐药菌株比例均在 80%以上;有 50.4%的ETEC对恩诺沙星敏感(71/141),中等敏感的为多粘菌素B占66%(93/141)、头孢噻肟占51.8%(73/141);多重耐药主要集中在8耐、9耐、10耐、11耐,占总ETEC的68%(96/141),分别为 17%(24/141)、16.3%(23/141)、19%(27/141)、15.6%(22/141),拥有10重耐药性的菌株占比最大。动物实验使用常规的ICR小鼠,小鼠攻毒试验通过初筛141株ETEC致病力,得到9株高致病力菌株,均能以1×107CFU致死小鼠。然后分别筛选优势血清型08和0101强毒株,以5×107CFU攻毒小鼠,发现08血清型中有8株为强毒株,占08血清型菌株总数的38.1%,0101血清型中有5株为强毒株,占0101血清型菌株总数的27.8%;综合初筛和单因子O抗原血清型强毒株筛选结果,测定08血清型一强毒株的半数致死量(LD50)为1.4×107CFU;最低致死量(MLD)为3×107CFU。3苏北地区猪产肠毒素大肠杆菌灭活疫苗的初步研究优势血清型单价灭活疫苗小鼠免疫效果结果显示,单价灭活疫苗对同种血清型的强毒株具有完全的保护,保护率为100%;用优势血清型的2株强毒株经灭活制成二价灭活ETEC疫苗,免疫小鼠能形成有效的保护效果,对两种优势血清型所有强毒株的保护率均在83%以上,对高浓度感染也具有较高保护率,且免疫无应激死亡,对其他血清型强毒株也有部分保护效果。比较免疫前后小鼠血清抗体效价,发现二免后血清抗体效价上升较快,但一免后攻毒小鼠也能形成有效保护;比较不同免疫剂量的免疫效果发现,以2×108CFU免疫小鼠的效果最佳;比较不同致病力菌株灭活疫苗的免疫保护效果发现,三种不同致病力菌株制备的灭活疫苗均能对小鼠形成有效保护。本研究通过对苏北地区猪产肠毒素大肠杆菌的流行病学调查,发现其优势血清型,整体耐药性,并初步研制出可用于防控分离株中大部分致病性ETEC的二价灭活疫苗,给养殖生产业提供了可行的监测和防控参考。