赤霉素和高效氯氰菊酯在小鼠肝细胞的联合毒性效应

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物质的日益丰富,人们对生活的品质相应提高了,不再是满足于吃饱,而是对食品安全日益关注起来。蔬菜水果是人民日常消费品,在日常消费中占重要的比重,安全问题也受到国家和消费者的重视。我国对于农药安全是近几年才慢慢发展,农民的意识依然淡薄,因此农药的滥用和缺乏规范的管理,导致现在依然有蔬菜水果农药检出超标现象。为了达到有效监管,检测方法简单实用准确率高及成本低成为检测部门一直的追求。除了追求检测方法改进,联合毒性也被重视,尤其是多种农药之间产生的效应。一直以来毒理学研究都采用活体动物试验或微生物和一些藻类,但是动物需要满足实验条件的很少,也会受到内心道德的约束,实验完的动物实验如果不处理好,会引发环境污染,微生物和藻类毒理试验又很难推用到人体上,离体细胞培养方法的出现克服了这些缺点,具有快速、简单、消耗低、作用靶点容易掌握等优点,成为近年来农药安全性评价的新贵。高效氯氰菊酯是蔬菜水果中检出率及超标率很高的一种农药,它具有的神经毒剂、遗传毒性等,另外植物激素能使农产品产量及卖相得到满意效果,近年来越来越受到农业生产欢迎。赤霉素因其能提高产量低毒因此在农产品上得到大范围的应用。所以研究其联合效应及检测方法的改进对今后农药残留限量标准制定和农药在人体安全性评价有所帮助。本论文研究了液相色谱串联质谱法同时测定蔬菜水果赤霉素和高效氯氰菊酯残留检测方法。待测试样经过乙腈振摇提取,经过盐析原理进行分层,吸取澄清乙腈层用50%甲醇水1:1(V/V)互溶,乙腈与5 mmol/L乙酸铵水进行梯度洗脱分离,采用电喷雾正负离子源模式(ESI+,ESI-)多反应监测(MRM)采集数据,外标法定量,离子比定性。毒性效应实验方面以代谢解毒的肝细胞为实验受试体,研究赤霉素和高效氯氰菊酯单独或混合处理下,以毒性指标为小鼠肝细胞存活率计算,并利用联合指数法(CI)评价两种农药对细胞毒性的联合毒性时采用新的评价方法联合指数法(CI)。同时,研究了两种农药单独或混合处理下,以细胞产生的肝毒性程度对细胞形态和蛋白浓度为毒性进行观测,评价两种农药对小鼠肝细胞联合肝毒性时采用新的评价方法联合指数法(CI)。此外,本论文对两种农药单独或混合处理下的氧化应激程度测定了细胞的SOD抑制率和MDA含量。并利用新的评价方法联合指数法(CI)对其进行了评价。主要的研究结果得到:(1)对两种农药进行3个水平添加(0.04、0.10、0.40 mg/kg)时的平均回收率在80.0%~112.1%之间,相对标准偏差(RSD)<15%。(2)2种农药的相关系数(R~2)均大于0.999;线性良好(0.01~0.40 mg/L);检出限(LODs)均为0.001 mg/kg,定量下限(LQDs)均为0.004 mg/kg,满足常规检测方法要求。(3)该测定方法简单、高效率、灵敏度高,具有良好的灵敏性、准确性和精密性,可为提高蔬菜水果的质量和安全性提供了耗材低、高效、可信的定性定量方法。(4)赤霉素和高效氯氰菊酯在有差异浓度、有差异时间下单一及混合处理时均会诱导小鼠肝细胞产生细胞毒性,导致肝细胞存活率的降低。其中,赤霉素在12 h、24 h、48 h及72 h时小鼠肝细胞的半数致死浓度分别为1732.9 mg/L、266.6 mg/L、69.3 mg/L及25.8 mg/L,高效氯氰菊酯在12 h、24 h、48 h及72 h时小鼠肝细胞的半数致死浓度分别为231.1 mg/L、57.8 mg/L、33.1 mg/L和24.8 mg/L。发现了赤霉素对小鼠肝细胞毒性曲线呈U型管状。高效氯氰菊酯的细胞急毒性略强于赤霉素。(5)赤霉素和高效氯氰菊酯在有差别浓度下单一及混合处理48 h均会诱导小鼠肝细胞产生肝毒性,引起肝细胞产生稀松不密集、胞体先变细后变圆、脱落等形态学变化,同时有差异水平地抑制小鼠肝细胞的蛋白浓度。赤霉素的肝毒性强于高效氯氰菊酯。(6)赤霉素和高效氯氰菊酯在有差异浓度下单一及混合处理48 h会使小鼠肝细胞产生氧化应激效应,抑制细胞抗氧化系统中的SOD抑制率,产生脂质过氧化反应导致细胞MDA含量的升高,进而加重氧化损伤程度。赤霉素引起小鼠肝细胞产生氧化应激效应比高效氯氰菊酯更高。(7)在本实验设计浓度下处理48 h,赤霉素和高效氯氰菊酯对小鼠肝细胞的细胞毒性由强拮抗转为协同效应,肝毒性的联合作用表现为强拮抗效应逐渐减弱的趋势,氧化应激效应由强拮抗转为协同效应,引起两种农药的等浓度复配合物对该细胞存活率、SOD抑制率的毒性在低浓度下都弱于两种农药单一使用。本论文的研究结果可为植物激素赤霉素和拟除虫菊酯类农药高效氯氰菊酯提供了低成本、高效率及简便的检测方法和为毒理学研究提供有效的数据参考,同时也为这两类农药对膳食及环境污染风险评估应支有效的参考。
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