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研究背景和目的第三次全国死因调查结果显示,脑血管病已成为我国城乡居民首位死亡原因,占死亡总数的22.45%,是单病种致死、致残率最高的疾病,已成为严重的公共卫生问题。脑梗死在脑血管病中最为常见,除发病4.5 h内及时溶栓治疗外,脑梗死至今尚无切实有效的根治方法。上世纪末开始,干细胞研究迅速发展。在干细胞及其治疗脑梗死的基础和临床前期研究方面成果众多。骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)作为细胞治疗的主要成员之一,具备取材方便、免疫原性低、很少涉及伦理、可自体移植等优点。目前,动物实验研究结果提示,BMSCs对脑梗死有治疗作用,能促进脑梗死后神经功能恢复；此外,临床试验近年来日益增多,部分结果证实BMSCs治疗脑梗死安全且有效,这些均给脑梗死的临床治疗带来希望。然而,BMSCs治疗脑梗死的确切机制至今尚未研究清楚。起初倍受关注的“细胞替代学说”遭到质疑。目前,大多学者认为,BMSCs的治疗作用可能与其分泌的各种因子有关。脑梗死能诱发自身内源性神经干／前体细胞(neural stem/progenitor cells, NSPCs)的增殖,这些增殖的细胞迁移到梗死灶周边(ischemic boundary zone, IBZ)并分化为神经元和胶质细胞。但是,大部分增殖的内源性NSPCs会在数天内凋亡,对脑梗死后神经功能的恢复作用有限。NSPCs的迅速凋亡可能与脑梗死后梗死周边极度缺乏血运和营养的恶劣微环境有关。本实验就脑内移植BMSCs促进大鼠脑梗死后血管新生,改善梗死周边微环境,从而激活内源性神经再生的机制进行探讨。方法采集正常成人男性志愿者骨髓,分离、纯化获得人BMSCs (human BMSCs, hBMSCs),体外培养扩增至第5代,进行细胞表型鉴定和染色体分析。线栓法建立雌性SD大鼠大脑中动脉栓塞2h再灌注模型(middle cerebral artery occlusion, MCAO),随机分为2组：①hBMSCs移植组,在模型建立后3d,脑内立体定向移植hBMSCs 5x105;②对照组,移植等体积生理盐水10μl。腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶(bromodeoxyuridine, BrdU),标记增殖的内源性NSPCS。(1)改良神经损伤严重程度评分(modified neurological severity scores, mNSS)和粘贴物移除实验分别评估神经功能恢复情况；(2)伊红-苏木素染色计算大鼠相对脑梗死体积；(3)18F-FDG micro-PET分析大鼠移植hBMSCs前后脑梗死周边代谢的变化；(4)BrdU和vWF荧光双染标记增殖的血管内皮细胞,CD31标记新生血管；(5)激光多普勒血流仪检测脑梗死周边脑血流变化；(6) BrdU、Nestin和：nusashil免疫荧光染色标记室管膜下区(subventricular zone, SVZ)和海马齿状回颗粒层下区(subgranular zone, SGZ)的NSPCs;(7)通过免疫荧光双染的方法研究NSPCs的迁移、分化和凋亡,BrdU+/DCX+细胞提示NSPCs向神经元前体细胞分化,BrdU+/NeuN+细胞提示NSPCs向成熟神经元分化,BrdU+/GFAP+田胞提示NSPCs向星形胶质细胞分化,BrdU+/TUNEL+细胞提示NSPCs凋亡；(8) western blot测定梗死侧脑组织VEGF、nestin、musashil、ki-67和DCX的表达量。(9)荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)追踪移植入大鼠脑内的hBMSCs。结果1、MCAO模型后2 w开始,hBMSCs移植组和对照组比较,行为学恢复更为明显,差异有统计学意义(P<0.05),表现为nNSS评分下降以及粘贴物移除实验中大鼠去除粘贴物的时间缩短。2、MCAO模型后12w,伊红-苏木素染色显示右侧大脑中动脉供血区域大脑皮质和基底核外侧梗死灶,hBMSCs移植组大鼠相对梗死体积为27.6%±4.8%,对照组大鼠相对梗死体积为36.4%±6.2%,差异有统计学意义(P<0.05)。3、MCAO模型后2 w, micro-PET吉果显示,hBMSCs移植组大鼠梗死侧皮质和纹状体摄取18F-FDG曾加,代谢缺损较对照组减少,差异有统计学意义(P<0.05)。4、同对照组比较,hBMSCs移植组大鼠脑梗死周边BrdU+/vWF+田胞和CD31阳性血管数量增多,梗死侧大脑中动脉供血区域脑血流(CBF)在MCAO模型后2w(移植细胞后11 d)明显升高,脑梗死周边VEGF表达量增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。5、同对照组比较,hBMSCs移植组SVZ区和SGZ区内源性NSPCs增殖、向IBZ区迁移以及向神经元和星形胶质细胞分化均显著增强,而NSPCs凋亡减少,另外,脑梗死侧nestin、musashil、ki-67和DCX的表达量增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。6、Y染色体荧光原位杂交技术(FISH)追踪移植入大鼠脑内的hBMSCs结果显示,hBMSCs移植入大鼠脑内12w后,仍可存活,但数量很少,存活的hBMSCs大多分布在脑梗死周边。结论脑内立体定向移植iBMSCs可以促进大鼠脑梗死后神经功能恢复,这可能与移植细胞促进梗死周边血管新生以及促进内源性神经再生有关。