E7070（又名Indisulam）是一种具有选择性杀伤部分肿瘤细胞的磺胺类抗癌药，目前处于临床二期研究阶段。近期研究报道E7070作用于CUL4-RBX1-DDB1-DCAF15（CRL4DCAF15）泛素E3连接酶复合体，识别并泛素化降解RBM39蛋白，引起mRNA剪切紊乱，从而导致肿瘤细胞凋亡。然而E7070依赖的CRL4DCAF15的作用机制与作用底物的研究还不是完全清楚，其未知底物的发现可以更好的对CRL4DCAF15依赖的药物机理机制研究提供帮助。基于质谱的蛋白底物鉴定现已成为一种成熟且常规的技术手段。目前蛋白质组学分析首选方法是使用蛋白消化酶（如胰蛋白酶Trypsin等）将蛋白质水解消化为肽段，而后通过串联质谱分析肽段序列，并根据二级质谱图进行肽段序列匹配。Trypsin是蛋白质组学中最常用的蛋白消化酶之一。然而，Trypsin由于选择性酶切蛋白酰胺键的C端，造成酶解得到的肽段在质谱碎裂的碎片离子的信号强度具有一定的偏向性，从而不利于特殊实验或样本的检测。为了解决Trypsin该偏向性，深度提高蛋白覆盖率及高质量进行特殊样本的检测，Lys-N、LysArgiNase以及LysC等蛋白消化酶亦被作为理想的蛋白消化酶，尤其LysArgiNase与LysN分别作为新开发的Trypsin和LysC的镜像酶，近年来逐渐被开发和应用于组学实验分析中，但目前也仅仅是对两种酶单独使用的研究，据报道该两种酶单独使用时存在遗漏酶切较严重、蛋白鉴定水平较低等不足。本文通过pulse-SILAC方法，为了更加深度提高蛋白质组覆盖率，分别使用Trypsin与LysN-LysArgiNase联用酶进行酶切，系统性挖掘E7070依赖的CRL4DCAF15的降解新底物，并验证了PRPF39很可能是E7070药物依赖的CRL4DCAF15潜在降解底物。本文系统全面鉴定出了CRL4DCAF15的底物蛋白，为今后深入探索E7070药物依赖的CRL4DCAF15降解底物蛋白的生物学意义，指出了明确的研究方向。该项方法学的建立，为今后类似蛋白降解类药物的靶点鉴定奠定了坚实的基础。　　在第二章节中，本文使用的Orbitrap Fusion质谱仪，建立了最优的扫描模式Q-OT-HCD-IT，并对其参数进行优化后，通过pulse-SILAC方法，使用Trypsin进行酶切，鉴定到了7，270个蛋白（肽段与蛋白水平FDR＜1％），其中12小时实验组中有3，190个蛋白在两次生物重复中均可定量，24小时实验组中有3，457个蛋白在两次生物重复中均可定量，生物学重复之间重现性良好(R2＞0.90)。分别有11个蛋白与9个蛋白（12小时实验组与24小时实验组）满足E7070给药组与对照组蛋白轻重标氨基酸替换比值1.5倍以上变化且p-value＜0.05的蛋白，提示了其可能为潜在E7070依赖的CRL4DCAF15的底物蛋白。　　在第三章节中，本文利用Orbitrap Fusion质谱对5种不同酶切方法进行系统性分析，一共分析了Trypsin;LysArgiNase;LysC;LysN;LysN-LysArgiNase这5种不同酶切方法下的Hela全蛋白裂解液的质谱结果，对其谱图质量、酶切位点特异性、漏切比例分布、鉴定蛋白数目与Mascot打分结果等指标进行探讨。分析得到LysN-LysArgiNase联用酶切方法相对于LysN或LysArgiNase单一酶切，赖氨酸漏切率下降近一倍，且可以鉴定到更多的蛋白数、肽段数及肽谱匹配数，提示了使用LysN-LysArgiNase联用手段相对于LysN或LysArgiNase单一酶切，可显著降低赖氨酸漏切率，并显著提高蛋白鉴定深度及序列覆盖率等。另一方面，LysN-LysArgiNase联用相比于Trypsin酶切而言不仅能够互补性的鉴定到更多特殊的蛋白，且有利于蛋白质C端序列的鉴定。本研究在国际上首次创新性的进行了LysargiNage和LysN的串联酶切在蛋白质组学样本制备中的使用，并对其酶切方法进行了优化，系统性对比了该新型串联酶切与常规酶切的优势，从而创新性的解决了此二种镜像酶单独使用的多种缺陷，不仅为该酶的使用方法提供了技术性指导，而且极大提升了此二种酶在组学研究中的广泛应用性，更为特殊样本如蛋白C端的鉴定、蛋白从头测序等研究提供了新的思路和方法。　　而后，本文在使用pulse-SILAC方法的基础上，使用LysN-LysArgiNase联用酶进行酶切，以达到进一步提高更加深度的蛋白质组覆盖率，从而鉴定到Trypsin常规酶切手段无法覆盖到的蛋白。本文使用pulse-SILAC方法与LysN-LysArgiNase联用酶切手段，一共鉴定到了6，982个蛋白，相比于Trypsin方法，额外鉴定到了1300余个蛋白。LysN-LysArgiNase联用酶切手段鉴定到了6个蛋白满足E7070给药组与对照组蛋白轻重标氨基酸替换比值1.5倍以上变化且p-value＜0.05的蛋白，提示了其可能为潜在CRL4DCAF15的底物蛋白。PRPF39蛋白与RBM39在Trypsin与LysN-LysArgiNase联用酶进行酶切实验中均被提示为潜在CRL4DCAF15的底物蛋白。由此，本文对PRPF39蛋白进行CRL4DCAF15的底物蛋白的生物学验证。PRPF39蛋白经生物验证其蛋白表达水平在E7070给药条件下显著下调，且其mRNA水平未发生改变。然而，在敲低DCAF15的细胞中，E7070则不能导致PRPF39蛋白表达水平发生变化，提示了PRPF39很可能是E7070药物依赖的CRL4DCAF15潜在降解底物。另一方面，本文还对E7070给药条件下生成速率减缓的蛋白进行了生物信息学分析，提示了E7070给药条件下生成速率减缓的蛋白的相关通路。本研究系统全面鉴定出了CRL4DCAF15的底物蛋白，为今后深入探索E7070药物依赖的CRL4DCAF15降解底物蛋白的生物学意义，指出了明确的研究方向。该项方法学的建立，为今后类似蛋白降解类药物的靶点鉴定奠定了坚实的基础。