论文部分内容阅读
目的：
新生隐球菌是一种高致死率的机会性致病酵母，其中VNI基因型新生隐球菌是新生隐球菌中最主要的致病基因型菌株。中国隐球菌病绝大部分（90％以上）是VNI基因型新生隐球菌引起的感染。以往针对中国新生隐球菌的分子流行病学研究往往是基于单个或几个基因位点序列信息的研究，无法精确解析相关菌株的种群结构、各种群间的演化关系及表型特征。本研究拟首次在基因组水平上对中国以及整个亚洲VNI基因型新生隐球菌进行群体遗传学分析和表型研究。第一部分拟研究中国VNI基因型新生隐球菌的基因组分型和群体遗传学特点;第二部分拟从群体基因组学的角度比较中国VNI基因型临床和环境分离菌株的群体遗传学特征的差异;第三部分拟利用全球VNI基因型新生隐球菌的基因组数据探寻整个亚洲VNI基因型隐球菌的种群结构和各群体之间的演化关系;第四部分通过隐球菌生长曲线、胞壁荧光强度和异质性耐药等表型实验以及GWAS分析的方法来探寻VNI型新生隐球菌的表型特点并找出可能与表型相关联的靶位基因集。
方法：
第一部分随机收集了来自中国不同省份的VNI基因型新生隐球菌临床株(26株)和环境分离菌株(23株);对相关隐球菌进行了PE文库构建和全基因组二代测序;通过系统发育学分析和全基因组SNP主成分分析的方法对中国VNI基因型新生隐球菌进行了基因组分型，并将分型结果与以往基于7个基因位点的MLST分型结果进行了比较;使用Tajimas D值和Fst值对中国VNI基因型新生隐球菌进行群体遗传学分析。
第二部分对中国VNI基因型新生隐球菌临床株群体和环境株群体分别进行了全基因组SNP密度分析和CLR正向选择检测，并找出有差异的基因组区域。提取出差异区域中包含的基因，并对其进行功能注释和GO通路富集分析。通过搜集整理构建VNI基因型新生隐球菌毒力基因库。
第三部分对亚洲VNI基因型新生隐球菌进行了全基因组SNP主成分分析和STRUCTURE分析;对亚洲VNI基因型新生隐球菌各群体的菌株进行了CLR正向选择检测，并对分析得到的目标基因集进行了功能注释和GO通路富集分析;通过TreeMix软件对亚洲VNI型新生隐球菌各群体间的演化关系进行了推算;通过Beast软件计算了亚洲三个VNI型新生隐球菌群体各自的起源时间;通过PopGenome软件进行了基因渗人分析;通过GATK软件进行了拷贝数变异分析。
第四部分对86株VNI型新生隐球菌进行了25℃生长曲线表型实验;对75株VNI型新生隐球菌进行了胞壁CFW荧光强度测定的表型实验;对109株VNI型新生隐球菌进行了中等浓度(32mg/L)氟康唑异质性耐药表型实验;对101株VNI型新生隐球菌进行了高浓度(64mg/L)氟康唑异质性耐药表型实验;并采用隐球菌基因组微进化和转录组分析的方法对新生隐球菌异质性耐药表型进行了更深入的研究;对上述表型实验结果均进行了GWAS分析。
结果：
第一部分中国VNI基因型新生隐球菌临床株感染的绝大多数病人为HIV阴性的病人(96.15％，25/26)。中国VNI型隐球菌群体主要划分为3个群体：China1，China2和China3。China1群体菌株在中国VNI型隐球菌中占据主导地位，其在临床株中占比为81％，在环境株中占比为61％。VNI型隐球菌全基因组分型结果与MLST分型结果不同，MLST分型下的ST359，ST360，ST226与ST5均属于基因组分型下的China1群体，ST31在基因组分型下分属于China2和China3两个群体，提示全基因组分型具有更精准的区分种群遗传多样性的能力;Tajimas D值的分析结果提示China1群体受到的正向选择作用远强于其他两个群体。
第二部分相比于环境株群体，中国VNI型隐球菌临床株群体有20个独有的高SNP密度基因组区域。这些区域共包含105个基因，并在胞壁荚膜合成相关的通路(GO：0030117)上富集。这105个基因中包含编码α-葡萄糖糖苷酶有关的基因，与隐球菌胞壁荚膜重构有关;CLR正向选择分析的结果提示中国VNI型临床株群体较环境株群体独有43个受高度正向选择的基因组区域。这些区域中包含与隐球菌胞壁几丁质及壳聚糖含量调控相关的基因，与隐球菌的胞壁荚膜重构有关。
第三部分全基因组SNP主成分分析的结果提示亚洲VNI型隐球菌大体分为3个主要群体：Asia1，Asia2和Asia3群体。在中国VNI型隐球菌中占主导地位的China1群体菌株全部属于Asia1群体。Asia1群体菌株在HIV阴性病人的隐球菌感染中占据绝对优势(73.2％，71/97)。TreeMix推算的结果提示在进化上Asia1群体处于新近发生的位置，Asia3群体处于较为祖先的位置。Beast推算的结果显示Asia1群体则起源于距今约2100年前，Asia3群体起源于距今约14万年前。全基因组CLR正向选择检测结果提示相比于Asia2和Asia3群体，Asia1群体独有40个受高度正向选择的基因组区域，这些区域包含了与新生隐球菌荚膜多糖调节相关的基因，且这些基因位于由Asia3群体向Asia1群体的基因渗入高峰区域中。分析发现21个Asia1群体与Asia2和Asia3群体均有拷贝数变异差异的基因。
第四部分亚洲温带亚热带地区的VNI型菌株的胞壁CFW荧光强度明显高于亚洲热带地区的菌株（p=1.832E-05＜0.01）;亚洲温带亚热带地区的VNI型菌株在25℃下生长速度明显快于亚洲热带地区的菌株(p=1.289E-06＜0.01);Spearman关联分析的结果发现亚洲VNI型菌株的胞壁CFW荧光强度与25℃生长速度成正相关(p=0.034＜0.05，R=0.25);GWAS分析得到6个可能与VNI型隐球菌25℃生长速度表型相关联的基因。GWAS分析共找到4个可能与氟康唑异质性耐药表型相关联的基因;基因组微进化实验检测到的33个发生微进化的非同义突变SNP中有4个落在GWAS分析找到的关联基因上;转录组分析找到了10个与异质性耐药有关的差异表达基因，其中包含编码醇脱氢酶的基因，而醇脱氢酶已被证明与念珠菌对氟康唑的耐药有关。
结论：
第一部分中国VNI型隐球菌在基因组分型下划分为3个群体，其中China1群体菌株占主导优势，且受正向选择作用最强。ST5型菌株属于基因组分型下的China1群体。
第二部分中国VNI型隐球菌临床株感染免疫正常人群的特殊能力可能与隐球菌胞壁荚膜重构有关，α-葡萄糖糖苷酶和几丁质酶相关的基因是可能的靶位。
第三部分China1群体菌株全部属于亚洲VNI型隐球菌基因组分型下的Asia1群体。Asia1群体菌株在感染HIV阴性病人中占具的优势可能与其胞壁荚膜的重构有关，α-葡萄糖糖苷酶相关的基因为可能的靶位基因。
第四部分胞壁CFW荧光强度和25℃生长曲线表型实验的结果表明亚洲VNI型隐球菌在感染免疫正常人群能力上的差异可能与隐球菌胞壁组分的改变和对低温环境的适应有关。分析发现VNI型隐球菌对氟康唑的异质性耐药表型与几丁质调节相关的基因和编码醇脱氢酶的基因密切相关，这将为临床中治疗氟康唑耐药的VNI型隐球菌引起的感染提供新的思路。
新生隐球菌是一种高致死率的机会性致病酵母，其中VNI基因型新生隐球菌是新生隐球菌中最主要的致病基因型菌株。中国隐球菌病绝大部分（90％以上）是VNI基因型新生隐球菌引起的感染。以往针对中国新生隐球菌的分子流行病学研究往往是基于单个或几个基因位点序列信息的研究，无法精确解析相关菌株的种群结构、各种群间的演化关系及表型特征。本研究拟首次在基因组水平上对中国以及整个亚洲VNI基因型新生隐球菌进行群体遗传学分析和表型研究。第一部分拟研究中国VNI基因型新生隐球菌的基因组分型和群体遗传学特点;第二部分拟从群体基因组学的角度比较中国VNI基因型临床和环境分离菌株的群体遗传学特征的差异;第三部分拟利用全球VNI基因型新生隐球菌的基因组数据探寻整个亚洲VNI基因型隐球菌的种群结构和各群体之间的演化关系;第四部分通过隐球菌生长曲线、胞壁荧光强度和异质性耐药等表型实验以及GWAS分析的方法来探寻VNI型新生隐球菌的表型特点并找出可能与表型相关联的靶位基因集。
方法：
第一部分随机收集了来自中国不同省份的VNI基因型新生隐球菌临床株(26株)和环境分离菌株(23株);对相关隐球菌进行了PE文库构建和全基因组二代测序;通过系统发育学分析和全基因组SNP主成分分析的方法对中国VNI基因型新生隐球菌进行了基因组分型，并将分型结果与以往基于7个基因位点的MLST分型结果进行了比较;使用Tajimas D值和Fst值对中国VNI基因型新生隐球菌进行群体遗传学分析。
第二部分对中国VNI基因型新生隐球菌临床株群体和环境株群体分别进行了全基因组SNP密度分析和CLR正向选择检测，并找出有差异的基因组区域。提取出差异区域中包含的基因，并对其进行功能注释和GO通路富集分析。通过搜集整理构建VNI基因型新生隐球菌毒力基因库。
第三部分对亚洲VNI基因型新生隐球菌进行了全基因组SNP主成分分析和STRUCTURE分析;对亚洲VNI基因型新生隐球菌各群体的菌株进行了CLR正向选择检测，并对分析得到的目标基因集进行了功能注释和GO通路富集分析;通过TreeMix软件对亚洲VNI型新生隐球菌各群体间的演化关系进行了推算;通过Beast软件计算了亚洲三个VNI型新生隐球菌群体各自的起源时间;通过PopGenome软件进行了基因渗人分析;通过GATK软件进行了拷贝数变异分析。
第四部分对86株VNI型新生隐球菌进行了25℃生长曲线表型实验;对75株VNI型新生隐球菌进行了胞壁CFW荧光强度测定的表型实验;对109株VNI型新生隐球菌进行了中等浓度(32mg/L)氟康唑异质性耐药表型实验;对101株VNI型新生隐球菌进行了高浓度(64mg/L)氟康唑异质性耐药表型实验;并采用隐球菌基因组微进化和转录组分析的方法对新生隐球菌异质性耐药表型进行了更深入的研究;对上述表型实验结果均进行了GWAS分析。
结果：
第一部分中国VNI基因型新生隐球菌临床株感染的绝大多数病人为HIV阴性的病人(96.15％，25/26)。中国VNI型隐球菌群体主要划分为3个群体：China1，China2和China3。China1群体菌株在中国VNI型隐球菌中占据主导地位，其在临床株中占比为81％，在环境株中占比为61％。VNI型隐球菌全基因组分型结果与MLST分型结果不同，MLST分型下的ST359，ST360，ST226与ST5均属于基因组分型下的China1群体，ST31在基因组分型下分属于China2和China3两个群体，提示全基因组分型具有更精准的区分种群遗传多样性的能力;Tajimas D值的分析结果提示China1群体受到的正向选择作用远强于其他两个群体。
第二部分相比于环境株群体，中国VNI型隐球菌临床株群体有20个独有的高SNP密度基因组区域。这些区域共包含105个基因，并在胞壁荚膜合成相关的通路(GO：0030117)上富集。这105个基因中包含编码α-葡萄糖糖苷酶有关的基因，与隐球菌胞壁荚膜重构有关;CLR正向选择分析的结果提示中国VNI型临床株群体较环境株群体独有43个受高度正向选择的基因组区域。这些区域中包含与隐球菌胞壁几丁质及壳聚糖含量调控相关的基因，与隐球菌的胞壁荚膜重构有关。
第三部分全基因组SNP主成分分析的结果提示亚洲VNI型隐球菌大体分为3个主要群体：Asia1，Asia2和Asia3群体。在中国VNI型隐球菌中占主导地位的China1群体菌株全部属于Asia1群体。Asia1群体菌株在HIV阴性病人的隐球菌感染中占据绝对优势(73.2％，71/97)。TreeMix推算的结果提示在进化上Asia1群体处于新近发生的位置，Asia3群体处于较为祖先的位置。Beast推算的结果显示Asia1群体则起源于距今约2100年前，Asia3群体起源于距今约14万年前。全基因组CLR正向选择检测结果提示相比于Asia2和Asia3群体，Asia1群体独有40个受高度正向选择的基因组区域，这些区域包含了与新生隐球菌荚膜多糖调节相关的基因，且这些基因位于由Asia3群体向Asia1群体的基因渗入高峰区域中。分析发现21个Asia1群体与Asia2和Asia3群体均有拷贝数变异差异的基因。
第四部分亚洲温带亚热带地区的VNI型菌株的胞壁CFW荧光强度明显高于亚洲热带地区的菌株（p=1.832E-05＜0.01）;亚洲温带亚热带地区的VNI型菌株在25℃下生长速度明显快于亚洲热带地区的菌株(p=1.289E-06＜0.01);Spearman关联分析的结果发现亚洲VNI型菌株的胞壁CFW荧光强度与25℃生长速度成正相关(p=0.034＜0.05，R=0.25);GWAS分析得到6个可能与VNI型隐球菌25℃生长速度表型相关联的基因。GWAS分析共找到4个可能与氟康唑异质性耐药表型相关联的基因;基因组微进化实验检测到的33个发生微进化的非同义突变SNP中有4个落在GWAS分析找到的关联基因上;转录组分析找到了10个与异质性耐药有关的差异表达基因，其中包含编码醇脱氢酶的基因，而醇脱氢酶已被证明与念珠菌对氟康唑的耐药有关。
结论：
第一部分中国VNI型隐球菌在基因组分型下划分为3个群体，其中China1群体菌株占主导优势，且受正向选择作用最强。ST5型菌株属于基因组分型下的China1群体。
第二部分中国VNI型隐球菌临床株感染免疫正常人群的特殊能力可能与隐球菌胞壁荚膜重构有关，α-葡萄糖糖苷酶和几丁质酶相关的基因是可能的靶位。
第三部分China1群体菌株全部属于亚洲VNI型隐球菌基因组分型下的Asia1群体。Asia1群体菌株在感染HIV阴性病人中占具的优势可能与其胞壁荚膜的重构有关，α-葡萄糖糖苷酶相关的基因为可能的靶位基因。
第四部分胞壁CFW荧光强度和25℃生长曲线表型实验的结果表明亚洲VNI型隐球菌在感染免疫正常人群能力上的差异可能与隐球菌胞壁组分的改变和对低温环境的适应有关。分析发现VNI型隐球菌对氟康唑的异质性耐药表型与几丁质调节相关的基因和编码醇脱氢酶的基因密切相关，这将为临床中治疗氟康唑耐药的VNI型隐球菌引起的感染提供新的思路。