论文部分内容阅读
研究背景:由VEGF诱导的糖尿病视网膜内新生血管的形成是糖尿病视网膜病变的主要特点。VEGF在体内和体外均可以诱导Ets-1的表达和ERK1/2的磷酸化,而在一些体外培养的细胞和动物模型中,VEGF的表达也同时受到Ets-1和ERK1/2的调控。但目前为止,关于Ets-1和ERK1/2在糖尿病动物模型视网膜内对VEGF表达的调控作用,以及Ets-1和ERK1/2的相互关系还很少报道。本研究的目的是通过链脲菌素(STZ)诱导的大鼠糖尿病模型来探讨糖尿病早期视网膜内VEGF,Ets-1和ERK1/2的相互关系。目的:1.检测糖尿病大鼠视网膜内转录因子Ets-1和细胞外信号调节激酶ERK1/2在血管内皮生长因子VEGF表达中的作用以及Ets-1和ERK1/2的相互影响。2.明确Ets-1和ERK1/2在视网膜中的定位表达以及VEGF受体Flt-1和KDR/Flk-1在实验性糖尿病早期大鼠视网膜内的表达情况。方法:1.选择8周龄,血糖在5-10mmol/L的雌性SD大鼠作为研究对象。每笼3只大鼠,按正常昼夜节律饲养,食水自由摄取。腹腔内单次注射65mg/kg STZ来诱导糖尿病。STZ用0.05mol/L,PH4.5的柠檬酸缓冲液配制。对照组腹腔内注射等量的稀释缓冲液。腹腔内注射STZ前16小时禁食水,腹腔内注射100mg/kg的戊巴比妥钠进行麻醉。每日于早8:00大鼠尾部采血用电子血糖仪进行血糖测量。腹腔内注射STZ后,大鼠饲养3月,每日观察外观和行为变化,每周测体重。STZ注射后24小时血糖值高于13.9mmol/L(250mg/dl)作为糖尿病模型成功建立的标准。实验过程中,对照组和实验组的年龄及数量相匹配。2.分别在诱导糖尿病后的1周、2周、4周、8周获取大鼠视网膜蛋白,检测Ets-1, ERK1/2和VEGF的表达的时序特点。用8周龄,血糖在5-10mmol/L的雌性SD大鼠作为对照。用Western blot检测分析蛋白水平。3.玻璃体内注射显性负相Ets-1病毒载体,观察抑制Ets-1表达在糖尿病大鼠视网膜内产生的效应。将大鼠麻醉,用33号注射针将1ul 1×1010斑点形成单位/ml的显性负相Ets-1病毒载体进行玻璃体内注射。一眼作为实验眼,另一眼作为对照眼,对照眼只注射等量的空白载体。所有大鼠均于腹腔内注射STZ后1,8,15天进行3次玻璃体注射,每次注射1ul。注射时,针从平坦部进入,避免损伤晶状体。首次玻璃体内注射后4周获取视网膜mRNA和蛋白样本,分别用Northern blot和Western blot进行检测分析。4.玻璃体内注射ERK1/2磷酸化抑制剂PD98059,观察抑制ERK1/2活化在糖尿病大鼠视网膜内产生的效应。PD98059用0.1%的DMSO(生理盐水稀释)配制为5mM的工作浓度,将大鼠麻醉后,用33号针玻璃体内注射2ul。一眼作为实验眼,另一眼作为对照眼,对照眼只注射等量0.1%的DMSO。所有大鼠均于腹腔内注射STZ后1,8,15天进行3次玻璃体注射,每次注射2ul。注射时,针从平坦部进入,避免损伤晶状体。首次玻璃体内注射后4周获取视网膜蛋白样本,用Western blot进行检测分析。5. STZ腹腔注射后4周,将大鼠麻醉后用4%多聚甲醛进行全身固定,取出眼球用4%多聚甲醛后固定2-4小时,之后将眼球置入20%蔗糖溶液浸泡沉底。用恒冷箱切片机将眼球沿视神经方向,切成14um的切片,贴于明胶玻片。切片用含有5%BSA、5%正常山羊血清及1%Triton X-100的0.01 M PBS封闭2小时。分别将pERK1/2和Ets-1多克隆抗体与GFAP单克隆抗体混合稀释,抗体终浓度分别为:pERK1/2 1:1000;Ets-1 1:100;GFAP 1:400。加入一抗后室温过夜,用0.01M PBS漂洗3次,每次5分钟。将Alexa 488标记的羊抗兔第二抗体(1:400)和Texas红标记的羊抗鼠第二抗体(1:600)混合,加入二抗后室温孵育2小时。0.01M PBS漂洗3次,5%甘油封片,激光共聚焦扫描显微镜观察结果。6.为检测糖尿病大鼠视网膜内VEGF受体的表达水平,STZ注射后4周,处死大鼠,获取视网膜总蛋白,用Western blot检测分析Flt-1和Flk-1的蛋白水平。7.实验结果用x±SD来表示。所有实验数据都用SPSS软件进行统计学分析。P<0.05或P<0.01作为统计学差异指标。结果:1.所有实验组大鼠体重明显低于对照组(P<0.01)。对照组大鼠体重逐渐增加,12周时平均体重高达285g,而STZ腹腔注射组大鼠只有注射后前2周体重缓慢增加,之后体重逐渐减低,12周时平均体重下降到156g。在整个实验过程中,链脲菌素注射组血糖值明显高于对照组(P<0.01)。对照组在实验过程中血糖稳定,血糖值总是低于10mmol/L。实验组大鼠STZ注射前血糖值与对照组相似,而注射后24小时则血糖值显著升高,超过13.9mmol/L,并在整个实验过程中稳定于高水平。2.链脲菌素注射后,糖尿病大鼠视网膜内Ets-1和VEGF蛋白表达呈时间依赖性升高,糖尿病诱导8周后二者蛋白水平分别达到对照的4倍和3.5倍(P<0.001)。但Ets-1蛋白水平上调时间早于VEGF。同时ERK1/2的磷酸化水平也与Ets-1表达相似,呈时间依赖性提高,8周时磷酸化水平达到对照的4.5倍(P<0.001)。3.玻璃体内注射显性负相Ets-1病毒载体后4周,Ets-1 mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.001)。同时,ERK1/2磷酸化水平及VEGF蛋白表达水平与空白载体注射组相比均显著降低,分别比对照组下降了60±4.0% (P<0.001)和58±6.0% (P<0.001)。实验中没有观察到与玻璃体内注射相关的视网膜脱离等并发症的出现。4.玻璃体内注射PD98059后,PD98059使ERK1/2的磷酸化水平下降了65±2.0%(P<0.001)。同时Ets-1和VEGF蛋白表达水平分别下降了45±6.0%和53±4.0%(P<0.001)。实验中没有观察到与玻璃体内注射相关的并发症出现。5.免疫荧光双标结果显示Ets-1和pERK1/2在视网膜各层的表达特点相似,表达Ets-1和pERK1/2的阳性细胞呈现典型的Muller细胞形态特点。而且,共聚焦显微镜观察显示表达Ets-1和pERK1/2的阳性细胞中GFAP呈现强阳性表达。节细胞层也有显著的Ets-1和pERK1/2的表达6. STZ注射后4周Flt-1和Flk-1的蛋白表达水平明显高于对照组,分别升高4.2和3倍(P<0.01)。结论:1.本实验主要得出以下几点:(1)糖尿病大鼠视网膜内Ets-1, pERK1/2和VEGF呈时间依赖性协同表达;(2)ERK1/2活化受Ets-1表达的调控;(3)Ets-1蛋白的表达依赖于ERK1/2的活化(;4)VEGF的表达同时受到Ets-1表达和ERK1/2活化的调控;(5)VEGF受体Flt-1和Flk-1伴随VEGF高表达。2.根据实验结果,我们推测在DR的发展中,VEGF,Ets-1和ERK1/2通过VEGF受体Flt-1和KDR/Flk-1发挥协同作用,并形成一个VEGF诱导的VEGF-VEGFR-ERK-Ets-1-VEGF自我正调控级联环路,这一环路的不断重复最终导致视网膜新生血管的产生。