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研究背景类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一典型由抗原驱动及T细胞介导的自身免疫疾病(AID),其特征为外周血中可检测出大量针对自身靶抗原的抗体以及抗原特异的T、B淋巴细胞。RA病因较复杂,发病机制不明确,病变主要涉及外周的小关节,最终会导致性关节破坏、畸形,甚至功能丧失,因此早期诊断并控制病情的发展尤为重要。目前RA的诊断标准主要依靠临床症状、血清学指标及影像学检查,实验室诊断过去多参考类风湿因子(RF)的检测,但特异性较差。2000年荷兰学者Schellekens用环瓜氨酸肽(CCP)作为抗原,建立检测抗CCP抗体的ELISA法用于RA诊断,显示了很强的疾病特异性。因而蛋白质的瓜氨酸化在RA发病中的意义越来越引起重视。RA的发病还涉及到一组重要的免疫分子-主要组织相容性复合体(MHC),人类为白细胞抗原(HLA)。遗传学研究表明,RA的易感基因为HLA-DR4(其中涉及到HLA-0405、0404、0401等诸多亚型),并可以作为判断其病情严重程度和预后的重要指标。据此认为RA发病的启动环节首先是致病抗原被抗原提呈细胞的HLA/DR分子提呈至细胞表面,以结合T细胞受体(TCR)形成抗原肽—HLA-DR4-TCR三分子的复合物,进而活化致病性的抗原特异性T细胞(AST),激活下游细胞因子介导的炎症反应和特定自身抗体的产生,「这一过程被认为是RA疾病发生、发展的中心环节。目的建立检测抗瓜氨酸化的热聚合(变性)兔IgG (Cit-AgRIgG)特异抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)与CCP抗原特异性T细胞(CCP-AST)的流式细胞术(FCM),明确抗Cit-AgRIgG抗体与CCP-AST细胞在RA患者、其他疾病与健康人群中的阳性检出水平,对其在RA临床诊断与应用中的价值进行评估。方法将纯化兔IgG置于62℃恒温水浴箱中进行热聚合变性,用肽基精氨酸脱亚胺基酶(PAD)作用使其瓜氨酸化(citrullination, Cit)制成Cit-AgRIgG,鉴定其与抗CCP抗体的结合活性,将其作为包被抗原建立检测抗Cit-AgRIgG抗体的间接ELISA法,进行方法学考核和临床病例标本检测,同时与RF检测(用未瓜氨酸化的AgRIgG作为包被抗原)和常规抗CCP抗体检测结果进行比对。以PerCP-Cy5.5标记的链霉亲合素(SA)结合生物素化CCP,作用于外周血T细胞,建立检测CCP-AST细胞的FCM分析技术,结果以CD3+CD4+CD8细胞群中CCP-TCR+细胞为CCP-AST细胞。评价其与抗CCP抗体的相关性,及与其他血清学指标检出结果的关系。探索CCP-AST细胞与抗Cit-AgRIgG抗体对RA的诊断性能。结果AgRIgG抗原经PAD在Ca2十存在下催化L-精氨酸生成L-瓜氨酸(瓜氨酸化)后,除保留与RF的结合特性,还增加与抗CCP抗体的结合活性。以瓜氨酸化AgRIgG作为包被抗原建立的检测抗Cit-AgRIgG抗体ELISA法具有良好的特异性和稳定性,重复性实验结果显示,其批内和批间平均变异系数分别为4.5%和9.5%；特异性阻断抑制试验显示,Cit-AgRIgG、AgRIgG与CCP抗原阻断抑制率最高分别为80.0%、65.9%、25.0%。临床检测结果发现抗Cit-AgRIgG抗体在RA中的阳性率(敏感性)为79.3%(138/174),显著高于其他疾病(χ2=444.6,P<0.001)与健康对照组(χ2=186.0,P<0.001)。此时诊断RA的特异性为96.2%(692/719)。该抗体与抗AgRIgG抗体(RF)在RA中的敏感性(77.6%,135/174)无显著性差异(产0.149,P>0.05),但与RF特异性(91.9%,661/719)差异显著(χ2=11.952,P<0.01)。抗Cit-AgRIgG抗体在RA中的阳性、阴性预测值分别为84.7%和95.1%；阳性、阴性似然比分别为22.66和0.215；Youden指数为0.758。ROC曲线分析结果显示该抗体对RA的诊断性能为中等偏上水平(AUCROC值=0.890)。在174例RA和127例健康对照者中,抗Cit-AgRIgG抗体与RF同时阳性者134例,同时阴性者160例,总符合率97.7%,两者呈高度正相关(r=0.989,P<0.01)并具有高度一致性(kappa值=0.953)。与此同时,抗Cit-AgRIgG与抗CCP抗体同时阳性者125例,同时阴性者151例,总符合率为91.7%,结果亦呈正相关(r=0.660,P<0.01)与良好的一致性(kappa值=0.833)。优化并确定了CCP-AST测定的流式细胞术最佳实验方案及反应条件,以CD3+CD4+CD8"淋巴细胞群中识别CCP-TCR+细胞作为CCP-AST细胞。研究发现RA患者的CCP-AST细胞阳性检出结果为(1.51+0.96)%,显著高于非RA患者组(0.39±0.18)%(P<0.01)；CCP-AST检出结果中,系统性红斑狼疮(0.57±0.15)%、其他自身免疫病(0.48+0.16)%、其他无关疾病(0.27±0.06)%与健康对照组(0.26±0.09)%间未发现有统计学差异。在RA患者组中,抗CCP抗体阳性者CCP-AST阳性率为(1.74±1.02)%,显著高于抗CCP抗体阴性者(0.90±0.46)%,差异有统计学意义(P<0.05),而抗CCP抗体阴性者又显著高于健康对照者(P<0.01)。相关分析结果表明,CCP-AST细胞检出率与抗CCP抗体水平值显著相关,相关系数(r)=0.7348(P<0.01,n=27),其回归方程为：Y=0.0041X+0.6318。以ROC曲线确定CCP-AST细胞的临界参考值(以所测实验肽减对照肽的差值大于0.815为CCP-AST细胞增高),确认27例RA患者中有19例CCP-AST细胞检出结果增高(70.3%),其中同时伴抗CCP抗体阳性者15例(55.6%)。两指标≥1项增高或阳性者23例(85.2%)。与CCP-AST检出率未升高组比较,升高与未升高组间C4浓度差异显著(P<0.05),但RF、C3、CRP、血沉及ASO水平未发现有统计学差异(P>0.05)。结论成功建立了抗Cit-AgRIgG抗体ELISA测定方法,方法特异、敏感、可靠,且该抗体兼有RF与抗CCP抗体的双重特性。检测抗Cit-AgRIgG抗体水平可作为RA诊断的一种新参考指标。采用PerCP-Cy5.5标记链酶亲合素结合生物素化的CCP,可实现对CCP-AST细胞的标记和检测。联合检测CCP-AST细胞与抗Cit-AgRIgG抗体可有效提高RA的诊断水平。