小反刍兽疫病毒血凝素蛋白及其受体的研究

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小反刍兽疫(peste des petits ruminants, PPR)是由副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)小反刍兽疫病毒(PPR virus,PPRV)感染小反刍动物引起的急性、热性、高度接触性的传染病。PPR自1940年首次记述发生于非洲以来呈扩大蔓延的趋势,2007年首次发生于我国西藏自治区。与其他病毒一样,PPRV侵染宿主细胞的“核心”机制是病毒与特定受体结合进而感染宿主细胞。因此,受体的分布、含量、结构决定宿主嗜性和组织嗜性。由于PPRV受体发现迟,而且PPR在我国属于新发外来病,所以关于受体特性及其与病毒相互作用的研究仍属空白。因此,本研究开展了PPRV血凝素蛋白(Hemagglutinin protein,H)及病毒受体—淋巴细胞信号活化分子子(Signaling lymphocyte activation molecule,SLAM)方面的研究。首先,本研究以PPRV Nigeria75/1株为对象,克隆H基因胞外区(tH基因),并分别在原核和真核表达系统进行了高效表达,表达量分别为4.68g/L和0.5~1g/L,免疫印迹分析表明重组蛋白均具有良好的免疫原性。同时,应用RT-PCR方法克隆获得了山羊SLAM基因,其ORF为1017bp,共编码338个氨基酸,与绵羊、黄牛、水牛、虎鲸和海豚SLAM基因同源性较高;与绵羊、黄牛和水牛一样,山羊SLAM蛋白V结构域中存在8个影响宿主—病毒特异性结合的8个关键氨基酸,胞内区含有三段高度保守的富含酪氨酸的基序;通过原核和真核表达系统均获得了具有良好免疫原性的SLAM蛋白。SLAM V结构域是与病毒蛋白结合的功能区,其中的关键氨基酸决定宿主与病毒相互作用的特异性。因此,本研究分别构建了pcDNA3.1-tH和SLAM及其缺失突变体(胞外区、无信号肽胞外区、胞外区N端29-136位氨基酸和胞外区C端137-240位氨基酸)的pEGFP-N1系列重组表达载体,共转染CHO-K1细胞,采用免疫共沉淀方法确定SLAM N端29-136位氨基酸是决定其与病毒蛋白结合的关键氨基酸区段。为了确定病毒组织嗜性与宿主体内受体分布的关系,本研究应用TaqMan荧光定量PCR和免疫组化方法,分析了PPRV和SLAM在山羊体内的组织分布和转录表达谱。研究发现,SLAM mRNA在山羊的40种组织中均有不同程度的转录表达,其中淋巴组织和鼻粘膜中的表达量较高;SLAM抗原在淋巴器官、消化系统、心、肝、肾和大脑等组织样品免疫标记阳性;除胰腺和肌肉样品外,人工感染山羊的其他被检样品中均可检测到PPRV,其中胸腺、扁桃体、肺门淋巴结、鼻甲骨中病毒载量明显高于其他组织,而且第3、5、28天的病毒载量较高,尤其是第5天;PPRV抗原广泛存在于呼吸系统、消化系统、淋巴组织、肝、肾、心和小脑等组织器官中。此外,建立了快速检测PPRV的两步法TaqMan荧光定量PCR方法,确定外周血是PPRV流行态势检测中最有价值的诊断材料,由第28天病毒载量的再次上升推断存在一定水平的持续性感染。由于在研究过程中发现病毒载量和SLAM表达谱存在明显差异,推测PPRV很可能还利用其他受体,因此本研究又通过病毒铺覆蛋白结合试验(VOPBA)对山羊外周血淋巴细胞(peripheralblood lymphocyte,PBL)膜受体进行了鉴定。结果发现PBL膜蛋白中存在两个与PPRV和PPRV tH蛋白结合的组分,分子量分别约为38ku和100ku,关于这两种结合蛋白的特性还有待于进一步深入研究。
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