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暴发性肝炎（Fulminant viral hepatitis，FH）是全球广泛存在的肝脏疾病，在中国其发病致死率逐年上升已经位列全球第三。导致暴发性肝炎的原因主要有5种，分别为：病毒性肝炎（HAV和HBV），药物滥用（扑热息痛），特殊药物反应，有毒物质的摄取以及机体的代谢紊乱，但因其具体发病机制还不是十分清楚，所以对暴发性肝炎进行研究尤为重要。建立暴发性肝炎模型的方法是运用小鼠肝炎病毒MHV-3诱导完成，此模型能很好的模拟暴发性肝炎发病过程，对其发病机制进行研究并制定相应的方案进行治疗。MHV-3是隶属冠状病毒科的单正链RNA病毒，它可以导致敏感品系Balb/c和C57BL/6小鼠发生严重的肝细胞坏死，致小鼠死亡。但对于抗性品系如A/J小鼠在感染病毒后则不表现出任何临床症状，经证实A/J小鼠体内补体C5分子由于缺乏特异性酶不能自然合成，所以我们推测补体C5分子参与了重症肝炎的发病，同时现如今文献和实验均指向暴发性肝炎的死亡原因与一种新型凝血酶原酶纤维介素2（Fibrinogen like protein2/fibroleukin, FGL2）密切相关，在暴发性肝炎中，FGL2能裂解凝血酶原为有活性的凝血酶，启动凝血级联反应，引起纤维蛋白沉积，致使血管内凝血，肝血窦血栓形成，肝细胞坏死，最终导致小鼠死亡，因而我们提出假设：暴发性肝炎发病中补体C5分子能对Fgl2进行直接或间接的调节而影响小鼠的存活。基于这样的假设，本研究以Balb/c小鼠和C5aRKO小鼠做为研究对象，MHV-3作为研究手段，辅以正常人和临床暴发性肝炎病人做为研究参照，旨在探讨补体C5分子活化产物C5a与其受体C5aR在暴发性肝炎发病中的作用及机制。补体系统作为先天免疫防御机制中的一部分，它的激活在维持细胞完整和调控适应性免疫应答中起着重要作用，已知补体的激活途径主要有3条：经典途径，旁路途经及凝集素途径。补体系统通过三种途径激活后能够保护机体并清除入侵的病原物质，同时通过活化后配体与受体的相互作用对细胞自身进行修正并调节。文献报道，急性感染模型如自身免疫性脑脊髓膜炎（EAE， experimental autoimmuneencephalomyelitis），气道变异性炎症及脓毒症中，补体活化产物C5a能够与其受体C5aR相互结合发挥作用，加速疾病进展，同时在这些疾病模型中均能检测到大量补体活化片段C5a的产生，致使炎症反应加重。MHV-3诱导的暴发性肝炎同属急性感染模型，那么在这样的模型中补体活化片段C5a是否也能与C5aR结合发挥作用，影响疾病进程呢？带着这样的疑问，我们首先用100PFU的MHV-3病毒感染Balb/c和C5aRKO小鼠，发现Balb/c小鼠在感染3天内全部死亡，相比相同剂量感染的C5aRKO小鼠，超过80%的小鼠在感染后得以存活；镜下观察Balb/c小鼠肝组织坏死区明显，而C5aRKO小鼠的肝脏形态则趋于正常；血清学检查也发现C5aRKO小鼠血清中谷丙转氨酶（alanine transaminase，ALT）水平明显低于Balb/c小鼠。此外，为进一步明确C5a/C5aR通路在暴发性肝炎中的作用，我们用C5aR阻断剂和生理盐水通过尾静脉方法注射入Balb/c小鼠体内，30分钟后相同条件下对两组小鼠同时感染MHV-3并观察两组小鼠存活及肝脏病损情况，结果显示MHV-3感染后，生理盐水处理组小鼠死亡率和肝脏坏死水平明显高于C5aR阻断剂组，提示补体C5a/C5aR通路参与暴发性肝炎的发病。众所周知，补体的激活通过3条途径完成，但无论哪一途径，最终都会级联激活C5分子，C5分子随后裂解成活化片段C5a和C5b发挥生物学功能。为明确补体系统在重症肝炎中是否激活，我们检测了MHV-3感染Balb/c小鼠72小时及临床暴发性肝炎病人补体的活化情况，免疫组化结果显示临床暴发性肝炎病人和MHV-3感染Balb/c小鼠72小时肝组织切片中，补体C5活化产物C5b-9和补体受体C5aR在肝组织局部大量沉积；定量多聚酶链反应（PCR，Polymerase chain reaction）和免疫印迹实验（WB，Western blot）结果显示MHV-3感染之后Balb/c小鼠肝组织C5aR表达随着时间推移呈上升趋势；外周血酶联免疫吸附测定（ELISA，enzyme linked immunology assay）显示暴发性肝炎病人和MHV-3感染Balb/c小鼠72小时后补体C5分子活化并有大量活化片段C5a的产生，这些结果均表明在暴发性肝炎中补体系统被激活并参与发病。进一步免疫组化和免疫荧光实验对C5aR进行组织定位，发现肝脏细胞中表达C5aR的主要是肝细胞和巨噬细胞。研究表明MHV-3感染小鼠导致小鼠死亡的原因为纤维蛋白原样蛋白2/纤维介素(FGL2, Fibrinogen like protein2/fibroleukin)的表达异常，因此我们检测了MHV-3感染72小时后Balb/c和C5aRKO小鼠血清中FGL2的表达，结果发现C5aRKO小鼠血清中FGL2的表达明显低于Balb/c小鼠组；免疫组化结果显示MHV-3感染72小时后Balb/c小鼠肝组织周围有大量FGL2及纤维蛋白原沉积，而C5aRKO小鼠肝组织周围几乎没有检测到FGL2及纤维蛋白原表达；免疫印迹实验结果也显示MHV-3感染Balb/c小鼠72小时后肝组织FGL2表达明显高于C5aRKO小鼠。这些结果均指向C5a/C5aR通路能够直接调节FGL2分子加重暴发性肝炎的发病，缺乏C5a/C5aR通路则能明显减少暴发性肝炎中FGL2的表达，减轻肝组织损伤，降低小鼠死亡率。通过文献查阅，我们发现MHV-3诱导的小鼠暴发性肝炎模型中，MAPK信号途径中的ERK和P38信号通路被激活，而C5a/C5aR通路在其他疾病模型如脓毒症，急性脑脊髓膜炎中能激活MAPK信号途径，所以我们推测在MHV-3感染的暴发型肝炎中，C5a/C5aR通路能激活MAPK信号途径参与FGL2的调节。丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK，Mitogen-activated protein kinase）信号通路在维持细胞正常生长增值及凋亡中起着重要作用，在急性感染模型中以ERK和P38的磷酸化尤为常见。因此，为明确暴发性肝炎中C5a/C5aR通路的具体机制及其是否通过诱导MAPK信号通路的磷酸化，调控FGL2的表达导致疾病发生，我们首先检测了MHV-3感染不同时间点Balb/c和C5aRKO小鼠肝组织ERK，P38的磷酸化水平，结果显示MHV-3感染后，Balb/c小鼠肝组织ERK和P38磷酸化水平高于C5aRKO小鼠；同时检测病毒感染后两组小鼠肝组织FGL2产生时发现C5aRKO小鼠的FGL2表达弱于Balb/c小鼠，提示当C5a/C5aR通路被阻断时小鼠体内肝组织磷酸化水平和FGL2的表达下调，明确在此模型中C5a/C5aR通路能够通过MAPK信号途径中ERK和P38的磷酸化对FGL2进行调节。为更进一步明确C5a/C5aR通路在暴发性重症肝炎中对FGL2的调节作用，我们选取了小鼠巨噬细胞系RAW264.7以及Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞作为研究对象，加以C5a，MHV-3，C5a+MHV-3，C5a+MHV-3+C5aRa作为研究手段对细胞进行体外刺激，72小时后Western blot检测ERK，P38的磷酸化水平以及FGL2的表达，结果显示C5a能明显促进MHV-3诱导巨噬细胞产生FGL2的能力，同时C5a也能增强MHV-3诱导巨噬细胞后ERK和P38的磷酸化水平，这在细胞层面上为C5a/C5aR通路通过MAPK途径调节FGL2提供可能。最后我们运用ERK和P38抑制剂作为研究手段，提取和培养小鼠巨噬细胞后将小鼠巨噬细胞分为C5a，MHV-3，C5a+MHV-3，C5a+MHV-3+ERKinhibitor，C5a+MHV-3+P38inhibitor5个刺激组，体外刺激细胞并检测FGL2的表达，结果发现ERK和P38阻断剂能明显抑制C5a刺激下MHV-3诱导的巨噬细胞FGL2的产生，提示C5a/C5aR是通过MAPK途径中ERK及P38磷酸化来完成对FGL2的调控，加重暴发性肝炎的发病。