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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epid emic diarrhea virus,PEDV)引起猪的一种急性、高度接触性传染病,所有年龄阶段猪只均可感染,临床症状主要表现为发热、呕吐、腹泻、脱水,7日龄以下仔猪致死率高达100%。目前,我国猪场预防PED主要依赖于饲养管理和疫苗免疫等措施,但该病依旧频发,PED仍然是我国养猪业的重大疾病之一,给我国养猪业造成巨大的经济损失。从乳汁中获得母源抗体,是仔猪免受PEDV侵害的重要途经。而血清中PEDV抗体的检测结果,能够间接反应出猪只是否感染或免疫后的个体保护水平。因此,血清或乳汁中PEDV抗体的检测极其重要。目前,针对猪流行性腹泻病毒抗体的检测方法有酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)、血清中和试验等。上述检测方法耗时长、需要精密的实验仪器设备、操作复杂且需要专业人员进行,无法满足临床快速检测的需要。因此,建立一种快速、简单以及灵敏的PEDV抗体检测方法十分必要。本研究以PEDV重组S1蛋白偶联羧基荧光微球制备时间分辨荧光免疫层析试纸条,通过比较检测线(T线)和质控线(C线)荧光强度值差异,定量检测血清或乳汁中PEDV IgG或IgA抗体水平,从而达到诊断PED或评价PED疫苗免疫效果的目的。本研究内容如下:1.PEDV IgG抗体时间分辨荧光免疫层析方法的建立本研究采用竞争法和荧光免疫层析技术相结合,以羧基荧光微球与PEDV重组S1蛋白偶联,以鼠抗猪IgG Fc片段单抗和PEDV S1单抗分别作为试纸条检测线(T线)和质控线(C线),制备PEDV IgG抗体时间分辨荧光免疫层析试纸条(PEDV IgG-TRFIA)。结果显示本方法检测纯化的PEDV IgG参考品最低检测限为23.772 mg/L,最佳避光反应时间为15 min,平均添加回收率为100.88%～102.70%,批内批间变异系数均小于15%,且本试纸条与PEDV IgA抗体、伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)阳性血清、猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)阳性血清、塞内卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)阳性血清和副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)阳性血清均无交叉反应。应用该方法与间接免疫荧光法(IFA)相比较,检测90份临床血清和60份临床乳汁样品其符合率分别为为95.6%和93.3%。综上,本研究建立的PEDV IgGTRFIA试纸条,具有灵敏、特异、准确、操作简便、检测快速的特点,可用于临床PEDV IgG抗体的快速检测。2.PEDV IgA抗体时间分辨荧光免疫层析方法的建立本研究采用竞争法和荧光免疫层析技术相结合,以羧基荧光微球与PEDV重组S1蛋白偶联,以商业化羊抗猪IgA抗体和PEDV S1单抗分别作为试纸条检测线(T线)和质控线(C线),制备PEDV IgA抗体时间分辨荧光免疫层析试纸条(PEDV IgA-TRFIA)。结果显示本方法检测纯化的PEDV IgA抗体参考品最低检测限为42.763 mg/L,最佳避光反应时间为15 min,平均添加回收率为100.66%～101.32%,批内批间变异系数均小于15%,且本试纸条与PEDV IgG抗体、PCV3阳性血清、HPS阳性血清和猪链球菌(Streptococcus suis,SS)阳性血清均无交叉反应。应用该方法与间接免疫荧光法(IFA)相比较,检测90份临床血清和60份临床乳汁样品其符合率分别为为96.7%和96.7%。综上,本研究建立的PEDV IgA抗体检测时间分辨荧光免疫层析试纸条,具有灵敏、特异、准确、操作简便、检测快速的特点,可用于临床PEDV IgA抗体的快速检测。综上所述,本研究建立了可定量检测猪只血清或乳汁中PEDV IgG或IgA抗体的时间分辨荧光免疫层析试纸条,符合临床快速检测方法的要求,具有潜在的临床应用价值,可为评价PED疫苗免疫效果或乳汁和血清中PEDV IgG与IgA抗体相关性研究提供技术支持。