肝癌(HCC)是一种发生于肝脏系统,具有明显民族聚集性和地域差异性的恶性肿瘤。美国癌症学会(ACS)2007年底公布的数据显示,全世界肝癌年增66.7万人,死亡59.8万人,新患肝癌55％发生在中国,HBV感染是最重要的诱因。目前,肝癌5年生存率尚不到10％,是仅次于胰腺癌(4.4％)的第二大高度恶性肿瘤。　　 根据肝脏肿瘤发生的病灶,肝癌可分为原发性肝癌、转移性肝癌和继发性肝癌三类。按肿瘤细胞起源可分为肝细胞癌及胆管细胞癌两类。其中肝细胞癌(HCC)在原发性肝癌中占95％,居我国肝癌发病率之首。　　 原发性肝细胞癌是一种发生在肝叶的肝细胞恶性癌变。但是原发性肝细胞癌的发病机理迄今尚未完全确定。近年来研究表明乙型、丙型肝炎病毒混合感染,黄曲霉毒素及其它化学致癌物质的摄入均为诱发肝癌的危险因素。　　 肝癌的发生与肝脏炎症因子过度表达有着很深的联系。在欧美以及其他东亚国家,肝细胞癌危险因素主要是HCV病毒感染及酒精性肝病,在慢性损伤的条件下,细胞反复受损与修复机制的持续激活可引发肝癌的形成和发展。肝炎病毒感染和长期饮酒极有可能通过这种方式诱发肝癌。Elsharkawy等提出肝脏炎症→纤维化→癌(IFC)轴线分子,则阐明由于炎症的正反馈作用,加重肝细胞的损伤,并诱导一系列肝细胞增殖修复机制,产生的炎症因子可以刺激受损炎症肝星状细胞(HSC)活化,促进肿瘤的发生。　　 Reg3A是再生蛋白Reg家族成员,胰腺癌候选癌基因。位于人染色体2P12.11,在人类基因组中的位置为nt79347594-m80875993之间。Reg3A基因全长2747bp,拥有3个mRNA剪切突变体,编码序列相同的分泌型蛋白因子。Reg3A蛋白质N端主要编码26个氨基酸长度的信号肽分子,其三级构象分析表明的有多糖结合功能的结构域主要在C端,预测其分子量为15kDa。它和Reg蛋白家族里的其他成员除了信号肽以及5’端保守序列以外没有其它相似性。　　 与C型凝集素蛋白家族类似,Reg3A已经证实参与了胰腺组织的损伤修复。它与cAMP竞争性的结合PKA通路受体,提高PKA/Ras/MEK信号转导通路对下游转录因子的磷酸化活性,从而激活下游一系列转录因子,对细胞增殖、分化、炎症应激,细胞周期等重要的事件进行相应的调控。最近研究者们发现这个基因还有一个重要的功能,那就是Reg3A的C端甘露多糖结合域可以和包括革兰氏阳性菌以及乙肝病毒甘露糖蛋白结合,并证明它是固有免疫应答信号转导通路中的一个新的分支。在炎症作用下或其他反复损伤机制的作用下,Reg3A作为免疫固有因子对侵入集体的病原体进行抵抗,同时作为一个细胞因子加速细胞的增殖分化,刺激细胞再生,充分体现了炎症具有一定的两面性,在炎症反应失衡的情况下,就会对机体造成额外的伤害。　　 Reg3A蛋白在胰腺肿瘤以及结肠肿瘤中高表达,并且能诱导肝脏细胞的增殖与分化。有临床报道表明,该基因在接受肝脏切除手术的患者以及动物模型中均呈高表达,并且其表达受到Wnt通路的间接调控,但是,该分子在肝脏肿瘤中表达模式以及其刺激肝细胞增殖与分化的具体信号通路目前仍不清楚。它对细胞增殖以及周期的影响方式除了在胰腺癌中有报道以外,在其他癌症中还未见有报道。本文主要研究该基因在肝癌细胞和组织中的表达,分析其对肝癌细胞凋亡与周期的影响,并通过双向电泳综合分析该基因下调后,肝癌细胞转录水平与蛋白质水平的变化差异,从而推测该基因在肝癌发生中所影响的细胞增殖与分化的信号通路。本文的研究内容主要包括以下4个部分:　　 第一部分:应用GEO数据库与HCCnet在线分析工具对GEO数据库已存在具有炎症风险因素临床病例的肝细胞癌表达谱芯片数据进行分析挖掘,证实Reg3A在大范围临床数据中的表达情况以及与其相关的信号通路,以及具有直接或间接交互作用的蛋白质分子,从而更好的指导下游实验的开展。　　 第二部分:收集92对临床肝癌组织样本(包括癌,癌旁)通过荧光实时定量PCR技术和组织芯片技术检测肝癌组织中Reg3A mRNA水平和蛋白水平的表达水平。通过实时荧光定量PCR,免疫印迹(Western-Blot)检测9种人肝癌细胞系中Reg3A的mRNA的表水平,以及蛋白质的表达水平,为下游Reg3A的细胞学研究筛选适合的细胞株。　　 第三部分:针对RegaA的CDS区设计合成引物。从人肝癌组织中提取总RNA,通过反转录PCR扩增获得目的基因片段。通过EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切及T4连接酶连接将其插入PCDNA3.1质粒中。通过质粒PCR及双酶切筛选并鉴定出阳性重组质粒,DNA测序鉴定其序列的保真性,将成功构建的pCDNA3.1-ReG3A真核表达载体转染第一部分中鉴定所得Reg3A低表达的肝癌细胞株,以G418进行抗性筛选,获得稳定转染细胞,使用免疫印迹以及免疫荧光的方法进行鉴定,通过细胞增殖(MTT法),细胞凋亡(FITC-PI双染),细胞周期,细胞集落形成,以及原位Tunel凋亡,确定Reg3A表达水平升高对肝癌细胞增殖,凋亡以及周期的影响。　　 第四部分:针对Reg3A3个mRNA剪切突变体的共同的CDS区域设计3对siRNA序列,以HepG2和Huh-7为靶细胞,通过实时荧光定量PCR以及Westen-Blot评估效果最佳的干扰序列,并构建对应的shRNA干扰质粒,建立稳定下调表达Reg3A的HCC细胞株。PSuper-sh336转染第一部分中鉴定所得Reg3A高表达的肝癌细胞株。通过一系列细胞学试验以及动物实验,确定Reg3A表达水平下调对肝癌细胞细胞形态学以及成瘤性的影响。以稳定下调Reg3A细胞为模型,使用蛋白质双向电泳以及质谱分析的方法,全面检测Reg3A分子下调后蛋白质谱的变化,初步推测受Reg3A分子影响拮抗细胞凋亡,促进细胞增殖的细胞信号通路。　　 实验结果说明,Reg3A分子在80/92例肝癌组织中上调表达,特别是在原发性巨大肝癌(瘤径>5cm)其mRNA表达水平比正常对照升高10倍以上。在肝癌细胞中,Sk-Hepl中Reg3A表达水平最低,故该细胞株用于下游试验中Reg3A过表达的研究,在其余7株人肝癌细胞株中,Reg3A均呈现不同水平的升高。　　 上调Reg3A分子表达能够显著促进细胞增殖,并拮抗由 TNF-a引起的细胞凋亡,下调Reg3A,能够显著抑制Huh-7,HepG2肝癌细胞的增殖,并将细胞周期阻止在G1-S期,裸鼠体内成瘤试验表明下调Reg3A分子,能够抑制肿瘤的生成。　　 双向电泳结果提示在下调Reg3A分子的情况下,PKC,Ras几条交互作用显著的信号通路均受到显著的影响,结合上游试验推测,Reg3A主要通过与激酶通路影响肝脏细胞的凋亡过程。　　 本课题通过实时荧光定量PCR与组织芯片在92例肝癌的临床样本中对Reg3A的表达水平进行鉴定。运用RT-PCR成功克隆其基因片段,构建得到pCDNA3.1重组表达载体,转染SK-Hepl肝癌细胞进行持续、稳定表达。通过评价3对体外转录的特异的shRNA在肝癌细胞中对Reg3A的干扰效果,构建效果最优化的shRNA载体。在Huh-7与HepG2肝癌细胞中稳定下调Reg3A的表达水平,通过增殖,凋亡周期,以及体内成瘤试验证实了Reg3A肝癌细胞增殖的促进作用。蛋白质组学的分析结果表明,Reg3A主要通过细胞的激酶通路起到作用。这些都为将来进一步研究Reg3A的功能及Reg3A作为肝细胞癌潜在治疗靶点的研究奠定基础。