骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)属于成体干细胞，是一类多能干细胞，在形态上与成纤维细胞、网状细胞、脂肪细胞和内皮细胞的形态相似。MSCs具有多相分化潜能已经被体内外实验验证。MSCs具有向软骨、骨、纤维组织分化的的能力。人MSCs在体外可以被诱导分化成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞。骨髓基质干细胞分离培养方法：密度梯度离心分离纯化法、全血培养贴壁法、免疫磁珠筛选、流式细胞仪分离等。由于MSCs表型不均一，分别具有间充质细胞、上皮细胞、内皮细胞的特点，目前没有鉴定MSCs的统一方法。在骨髓贴壁培养中最常见的为成纤维细胞和造血细胞，因此实验中一般选择这些细胞具有代表性的抗原进行检测。MSCs常常表现，CD29、CD 44H、CD 71、CD 90、CD 106、CD 120a、CD 124、CD 1 66、SH1、SH2、SH3、SH4、SB10呈阳性。CD 1a、CD 14、CD 34、CD 45、CD56、ESA呈阴性。 骨髓基质干细胞由于以下特性成为软骨组织工程领域的研究热点。首先，一些实验证明，MSCs可被诱导分化为软骨细胞，并在体内形成软骨组织，MSCs在体外经诱导分化培养成软骨细胞作第四军医大学博士论文为自体软骨修复的来源，可以避免同种异体软骨移植的免疫排斥反应。第二，MSCs取材方便，体外增殖能力很强，数毫升骨髓即可在体外培养获得可用于临床的细胞数量，克服自体软骨细胞取材困难和数量有限的问题。MSCs可以很方便地通过抽取骨髓来得到，而不必通过手术从病人身上得到自身成熟细胞，避免了对病人造成不必要的二次创伤。第三，MSCs用于自体软骨缺损的修复，避免用胚胎干细胞移植可能带来的一系列伦理问题。第四、在体外培养过程中，MSCs可以保持未分化表型并不断增殖，达到所需的数目，然后经诱导可定向分化为所需表型的细胞;而已分化的软骨细胞来源有限，在体外培养时，增殖速度较慢，还存在去分化的问题。 关于MSCS的软骨分化研究大多数的研究集中在两方面:1、体外应用各种因子和因素模拟体内环境诱导MSCS发生软骨分化和相关机理的研究;2、接种MSCs到生物支架上移植到动物皮下或者软骨缺损区观察形成软骨的效果，以及相关机制的探讨。但是，完全体外仿真模拟体内关节腔环境还存在极大困难，我们直接将MSCs复合生物材料移植到关节腔，观察在真实环境中的分化。在体外，摸索了低密度扩增MSCs的方法，观察了关节液和关节滑膜细胞诱导MSCs向软骨细胞表型分化。另外分离培养人胎儿骨髓基质干细胞，转染主控软骨分化的转录因子soxg基因，观察了MSCs的软骨细胞表型分化。 实验一:分离培养MSCs，探讨低密度高效扩增MSCs的方法。方法:本实验采用Percoll梯度离心分离联合贴壁培养分离纯化绵羊骨髓基质干细胞，经免疫组化鉴定发现分离培养的细胞大部分表达CD44、CD166，然而不表达CD34、CD45，说明本实验分离培养第四军医大学博士论文的绵羊骨髓细胞为骨髓基质干细胞。结果:不同密度接种的MSCs在12天培养期内，细胞宽度和面积发生变化，密度为10eells/c mZ、50cells/cmZ，第七天宽度和面积达到最大值，以后降低，100cells/c mZ、1000cells/cmZ第五天达到最大值，以后降低。locells/emZ、SOeells/emZ能够保持更长时f司的小形态MSCs，可能是细胞能够高速扩增的原因之一。12天培养期内，低密度接种(loeells/c mZ、socells/emZ)的Mses增长倍数和集落形成率都较高密度(looee一15/c mZ、l000eells/emZ)接种的大，具有显著差异。loeells/c mZ、soeells zcmZ密度接种增长倍数可以分别达到650和一066倍，而200 cells/emZ、looocells/emZ密度接种可以达到460倍和64倍。10 cells/c mZ、50 cells/ctn2、100 cells zemZ、2000 cell:/c mZ四种密度接种75 cmZ培养瓶，培养12天后分别得到0.8xl护Mscs、2.1 x lo6Mses3.4xlo6Mses4.sxlo6MsCs。结论:低密度接种可以高速扩增MSCs。 实验二:MsCs复合磷酸三钙(p一Triealeium phosphate，p一TCP)移植关节腔观察骨髓间充质干细胞在关节腔中能否分化成软骨。方法:选用12只1岁龄中国美利奴绵羊为实验对象，抽出中国美利奴绵羊骨髓，分离纯化并经过体外扩增。MSCs和冬TCP复合，移植到自体膝关节腔，观察MSCs的软骨分化。在4周、8周分别取材，采用苏木精一亮绿一番红花一“O”染色和甲苯胺蓝染色，观察复合体内蛋白聚糖(GAG)的形成。采用H型胶原和骨钙素免疫组化染色方法分析复合体内向软骨分化和向成骨分化的情况。结果:MSCS/p一TCP复合体能表达蛋白聚糖和H型胶原，不表达骨钙素。结论:MSCs能在关节腔环境中发生软骨分化表型，表达n型胶原，合成细胞外基质GAGs。第四军医大学博士论文 实验三:PKH26标记MSCs复合聚乳酸和聚乙醇酸共聚合物(poly(laetide一eo一glycoide)，pLGA)移植关节腔的实验研究。观察PKH26荧光染料标记的骨髓间充质干细胞在关节腔中的能否分化成软骨细胞。方法:选用12只1岁龄中国美利奴绵羊为实验对象。抽出骨髓，分离纯化并经过体外扩增(用10ocens/cmZ低密度扩增MSCS)，PK26红色荧光燃料标记，MSCs和PLGA复合，移植到自