随着聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)微流控芯片的普及,液滴微流控技术在很多研究方向中作为反应平台和技术工具得到了广泛的应用。微液滴的小体积和液滴间彼此隔绝的特性使其在分子生物学研究方法中占有一席之地,许多研究通过将分子反应体系包裹在大量微液滴内,获得不同于宏观条件下的反应结果。多重链置换扩增技术(multiple displacement amplification,MDA)是一种常用于全基因组扩增的非特异性DNA扩增技术。通过将MDA体系分散成许多彼此隔绝单元,液滴MDA(droplet MDA)反应对核酸扩增的一致性通常优于普通MDA反应,正被越来越多地应用于单细胞、宏基因组等研究领域。然而,这两种MDA方案在反应原理上并没有差异,溶液中的核酸浓度在反应开始后很长一段时间内上升非常缓慢。本课题致力开发一种基于微流控液滴平台的快速MDA反应方法,能够通过液滴加样的方式控制液滴内的核酸一直处于恰当的浓度水平,从而缩短液滴MDA扩增的时间。本课题的主要研究内容如下:1.搭建微液滴操控分析平台本课题设计并使用软光刻工艺流程自制了PDMS微流控芯片,通过灌注低熔点合金的方式在芯片中集成了精度较高的微电极。通过注射泵的外部控制功能实时控制输出模式,能够以不同的信号模拟出不同流体波动环境下的流体输出。在搭建好的微流控平台上生成并操控分散在氟油中的液滴,使用脚本配合软件自动进行大量液滴图像的分析。通过以上步骤实现并优化了普通微流控液滴实验中的实验流程,能够稳定地进行液滴操控实验,为微液滴实验提供了基础。2.优化液滴融合技术、提出新的液滴加样方式液滴融合是一种常用的液滴加样技术,但传统的一对一液滴融合存在着鲁棒性差的问题。本课题创新地提出了“自调节”液滴融合方法。该方法通过调节液滴尺寸参数获得了显著高于传统方法的鲁棒性,将波动条件下的融合成功率由~30%提高到~70%。这种方案将传统方案中融合成功或失败的二元化结果转变为了加样体积在一定范围内的震荡偏差。对液滴在融合前的位置关系的分析说明,自调节方案中两组即将融合的液滴能够在其自身尺寸差异的诱导下自动改变相对位置:要融合的液滴靠近而不融合的液滴相互远离。在此基础上,本课题还提出了另一种液滴加样方式:“混合生成”液滴加样。这种加样方式将一组液滴替换成为水相,采取了先破乳(融合)后再生成液滴的方案,使加样能够在流动聚焦的芯片结构中完成。本方法加样成功率略高于自调节方案,并且多次实验的离散系数由~10%降低至~5%,同时尺寸偏差不会随加样次数一起增大,更适用于本课题中重复多次的加样实验。3.通过逐级稀释法实现快速液滴MDA本课题提出了“逐级稀释法”缩短MDA反应所需的时间。这种方案的关键在于控制MDA体系中的核酸浓度:通过缩减MDA起始体积并提高核酸起始浓度,提高反应初期的分子碰撞概率、缩短MDA的缓慢扩增期;在反应进行到快速扩增时期的末期时将核酸浓度进行稀释同时维持其他组分的浓度,使扩增得以继续维持在快速阶段。由MDA体系中的荧光强度计算荧光增长率,划分了判断MDA快速扩增期和反应达到饱和的阈值范围并基于此优化了稀释时间参数。经过优化的MDA体系在总稀释倍数为10~4时,扩增时间仅为低起始核酸浓度MDA体系的~1/4。在评估液滴MDA在不同起始核酸浓度下的均匀性表现后,设定稀释总倍数为10~3。使用本课题提出的液滴混合生成方法对分散在氟油中的MDA体系进行逐级加样稀释共10~3倍,反应时间缩短至对照组的~2/5,有效缩短了反应时间。